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摘要

如何應(yīng)對突發(fā)性大規(guī)模傳染疾病已成為全球范圍內(nèi)的研究熱點，美國FDA緊急批準(zhǔn)上市的首款mRNA疫苗BNT162b2對新型冠狀病毒展現(xiàn)出了良好的療效，不僅為突發(fā)性傳染病提供新的解決思路，在藥物研發(fā)領(lǐng)域也引起了廣泛關(guān)注。然而，mRNA分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，需要借助載體才能進(jìn)入目標(biāo)靶位發(fā)揮藥效。mRNA藥物遞送載體成分復(fù)雜，是引起藥物不良反應(yīng)的主要因素，可能會引發(fā)不同類型的不良反應(yīng)，如免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等。本文主要探討mRNA藥物相關(guān)載體中潛在的安全性風(fēng)險，以及在非臨床安全評價中的考慮要點和參考案例，為探索和構(gòu)建mRNA藥物的科學(xué)的安全性評價方法提供參考。

關(guān)鍵詞

mRNA藥物; 載體; 毒性; 非臨床安全評價; 不良反應(yīng)

mRNA藥物是一類通過遞送系統(tǒng)將編碼好的外源mRNA遞送進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并由宿主翻譯系統(tǒng)表達(dá)特定功能蛋白，從而實現(xiàn)預(yù)防疾病或治療作用的生物制劑。作為一類極具前景的新型藥物，mRNA藥物相較于傳統(tǒng)藥物的優(yōu)勢有以下幾點: ①藥物研發(fā)周期短，能夠快速響應(yīng)突發(fā)性疫情。②安全性高，在載體的輔助下，mRNA藥物于細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮功能，不會整合進(jìn)入宿主基因組[1]。③mRNA藥物產(chǎn)物為蛋白質(zhì)，能夠通過生物代謝途徑被完全降解[1]。④mRNA疫苗具有佐劑效應(yīng)，能夠有效提高機體免疫應(yīng)答能力，進(jìn)一步增強機體免疫力[2]。mRNA藥物由mRNA分子與納米載體構(gòu)成，mRNA分子包含5'端帽結(jié)構(gòu)、3'端帽結(jié)構(gòu)與Poly(A)尾、開放閱讀框(open reading frame，ORF)及其周圍的5'非翻譯區(qū)(5'untranslated region，5'UTR)和3'非翻譯區(qū)(3'un translated region，3'UTR)構(gòu)成。兩端的帽子結(jié)構(gòu)和Poly(A)尾能夠影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[3]，5'UTRs和3'UTRs能夠提高藥物表達(dá)水平、翻譯效率和半衰期[4]，見圖1。mRNA分子為天然產(chǎn)物，對機體產(chǎn)生的毒性較小，主要的毒性由藥物載體引起，mRNA藥物遞送載體目前主要為脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles，LNPs)，在研的遞送載體有無機納米顆粒載體、外泌體、病毒樣納米顆粒載體等。迄今為止，共有15款mRNA藥物獲批上市(見表1)，其中包括美國FDA批準(zhǔn)的疫苗: 輝瑞和BioN Tech聯(lián)合研發(fā)的首個新型冠狀病毒(以下簡稱“新冠病毒”)疫苗復(fù)必泰，以及由Moderna研發(fā)的新冠病毒疫苗Spikevax和首個非新冠病毒適應(yīng)證疫苗mRESVIA等。在中國，國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了中國石藥集團有限公司、中國斯微生物科技股份有限公司和中國艾博生物等研發(fā)的新冠病毒疫苗共8款產(chǎn)品。

mRNA藥物作為近年來藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點之一，有許多藥物處于臨床前研發(fā)階段，藥物在臨床前的安全性評價數(shù)據(jù)相對有限。本文通過深入探討不同載體系統(tǒng)的潛在毒性、作用機制并對載體的安全性評價方法進(jìn)行了系統(tǒng)梳理，為探索和建立適用于mRNA藥物的安全性評價科學(xué)方法提供參考。

1潛在安全性風(fēng)險

1.1 LNPs載體的毒性風(fēng)險

1.1.1 不良免疫效應(yīng)

LNPs由輔助脂質(zhì)、膽固醇、聚乙二醇化脂質(zhì)(PEGylated lipids，PEGs)、可電離的陽離子脂質(zhì)混合而成[5]。輔助脂質(zhì)和膽固醇具有結(jié)構(gòu)支撐和穩(wěn)定作用，PEGs會促進(jìn)LNPs的穩(wěn)定性，可電離的陽離子脂質(zhì)能與帶負(fù)電荷的mRNA分子結(jié)合，促進(jìn)mRNA分子從內(nèi)核體轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而與核糖體結(jié)合，翻譯出相關(guān)蛋白質(zhì)[6]。PEGs是LNPs中引起免疫相關(guān)不良反應(yīng)的主要成分[7]，其具有免疫原性，會導(dǎo)致一種補體相關(guān)的類過敏反應(yīng)(CARPA)。PEG化藥物會導(dǎo)致患者體內(nèi)抗PEG的IgM和IgG上升，這些抗藥抗體會中和藥物，降低藥物的臨床療效。此外，由PEG化藥物產(chǎn)生的抗藥性抗體，會加速藥物的血液清除，導(dǎo)致療效降低和超敏反應(yīng)或遲發(fā)型超敏反應(yīng)[8]，甚至過敏性休克和死亡。mRNA疫苗tozinameran和CX-024414是歐盟使用的2種新冠病毒疫苗，接種疫苗的部分患者出現(xiàn)心肌炎或心包炎[9]，研究發(fā)現(xiàn)每100萬例接種疫苗CX-024414的患者出現(xiàn)心肌炎的概率為17.27例，出現(xiàn)心包炎的概率為9.76例; 每100萬例接種tozinameran疫苗的患者發(fā)現(xiàn)心肌炎的概率為8.44例，出現(xiàn)心包炎的概率為5.79例。有觀點認(rèn)為是疫苗接種后引起炎癥發(fā)生所致的不良反應(yīng)[10]，還有觀點認(rèn)為疫苗接種的強效免疫原性RNA可能對心臟有旁觀者效應(yīng)或輔助作用[11]。

1.1.2 炎癥反應(yīng)

在mRNA藥物Spikevax的評估報告中提到mRNA-LNP疫苗肌肉注射后可在腦內(nèi)檢測到極低水平的mRNA，這預(yù)示著mRNA-LNP復(fù)合物能夠跨越血腦屏障，到達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)，但未檢測到神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)。mRNA-LNP疫苗會引起強大的體液免疫反應(yīng)，導(dǎo)致接種部位產(chǎn)生急性炎癥不良反應(yīng)，如疼痛、腫脹、發(fā)熱等[12]，可能與陽離子脂質(zhì)引起的炎性反應(yīng)有關(guān)。陽離子脂質(zhì)的炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為肌肉疼痛、頭疼和高熱[13]，這可能與陽離子脂質(zhì)誘導(dǎo)以補體激活和細(xì)胞因子IFN-γ，TNF-α，IL-6，IL-12誘導(dǎo)為特征的強烈的炎性反應(yīng)有關(guān)[14]。

1.1.3 其他不良反應(yīng)

陽離子脂質(zhì)引起的不良反應(yīng)主要包括細(xì)胞毒性、炎癥反應(yīng)、肝毒性、白細(xì)胞減少、血小板減少等[15]。陽離子脂質(zhì)表面具有高密度的正電荷，會導(dǎo)致大量的活性氧(ROS)生成[16]，ROS誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡[17]，降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，影響細(xì)胞膜上的離子通道與信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[18]。陽離子脂質(zhì)還能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞器膜相互作用，影響膜的完整性和功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常的生理功能。陽離子脂質(zhì)的肝毒性主要表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶升高，如谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶。庫普弗細(xì)胞會吞噬脂質(zhì)復(fù)合物，是LNPs在肝中蓄積的主要原因[13]。血液學(xué)檢查表現(xiàn)為白細(xì)胞減少和血小板減少。

1.2 外泌體納米顆粒載體的毒性風(fēng)險

外泌體是細(xì)胞分泌的傳遞信息的納米級囊泡[19]，其直徑在40~160nm之間，因其具有良好的耐受性和生物相容性和較低的免疫原性[20]，被認(rèn)為是一種極具前景的納米藥物遞送載體。外泌體作為藥物載體使用，已經(jīng)用于免疫系統(tǒng)疾病、腎損傷疾病、癌癥等多種疾病的藥物治療研究。需對其安全性進(jìn)行評估，外泌體可能具有神經(jīng)毒性和生殖毒性風(fēng)險，作為納米顆粒載體，其納米尺寸可能使其具有穿透血腦屏障的能力，從而引發(fā)神經(jīng)毒性[21]。免疫原性也是外泌體可能存在的毒性風(fēng)險，外泌體的組分復(fù)雜，經(jīng)過特殊靶向修飾后可能導(dǎo)致免疫原性和免疫毒性。

1.3 無機納米顆粒載體的毒性風(fēng)險

1.3.1 肝臟和腎臟毒性

無機納米顆粒是一種穩(wěn)定性高、生物相容性良好、不良反應(yīng)小的新型藥物載體，種類豐富，包含有銀納米顆粒、金納米顆粒、氧化鐵納米顆粒等。無機納米顆粒對人體重要器官可能存在潛在的風(fēng)險，包括肝臟、腎臟[22]、大腦、睪丸和心臟[23]。研究表明，金屬納米顆粒會在肝臟中蓄積，會導(dǎo)致肝毒性，損害肝功能[24]，還會誘導(dǎo)肝臟的氧化應(yīng)激和炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致肝損傷。腎臟也會受納米顆粒誘導(dǎo)產(chǎn)生腎毒性、腎臟炎癥和功能障礙[25]。納米顆粒所導(dǎo)致的毒性可能與多種細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、質(zhì)膜、高爾基體和細(xì)胞核[26]。金屬納米顆粒毒性的產(chǎn)生與線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，因為線粒體是ATP生成、凋亡調(diào)節(jié)、ROS清除以及與其他細(xì)胞器相互作用的主要場所，承擔(dān)著維持細(xì)胞功能的重要作用。Jarrar等[27]研究表明，銀納米顆粒可以誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如肝細(xì)胞線粒體呈多形性、基質(zhì)透明和嵴斷裂。納米銀顆粒也會導(dǎo)致腎臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，如近曲小管細(xì)胞刷狀緣微絨毛密集。金納米顆粒會導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體損傷，表現(xiàn)為腫脹、透亮基質(zhì)和膜破裂，對腎臟的影響為腎臟遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹、嵴溶解、偶見線粒體膜破裂。線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變表明線粒體滲透壓和線粒體膜的完整性發(fā)生改變，進(jìn)而影響到線粒體的功能。無機納米顆粒會通過氧化應(yīng)激、免疫系統(tǒng)激活和大分子相互作用等不同機制誘導(dǎo)線粒體損傷。

1.3.2 遺傳毒性

無機納米顆粒產(chǎn)生生物毒性的因素有多種，如物理損傷、生物相互作用等。因為無機納米顆粒的粒徑較小，易于浸潤細(xì)胞內(nèi)部，對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，進(jìn)入胞質(zhì)中的無機納米顆粒主要存在于胞質(zhì)中，會干擾細(xì)胞的代謝功能，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死。納米顆粒還會產(chǎn)生ROS自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加劇細(xì)胞損傷。

1.4 病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)載體的毒性風(fēng)險

VLPs是一種復(fù)雜的多聚體，具有能夠進(jìn)行自組裝的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，直徑為20~200nm，病毒樣顆粒與天然病毒的形態(tài)相似但不包含親代病原體的物質(zhì)，mRNA與VLPs上的衣殼蛋白特異性結(jié)合即可形成VLP-mRNA復(fù)合物，由于復(fù)合物粒徑較小，易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮藥效。VLPs常見的局部不良反應(yīng)有注射部位疼痛、腫脹，該不良反應(yīng)與VLPs刺激機體所產(chǎn)生強烈的炎癥反應(yīng)相關(guān)[28]。全身不良反應(yīng)有疲勞、胃腸系統(tǒng)癥狀和頭痛。

1.5 其他納米顆粒載體的毒性風(fēng)險

仿生納米顆粒載體的組成結(jié)構(gòu)為功能性納米顆粒和細(xì)胞膜涂層，通過攜帶有化療藥物、基因藥物的功能性納米顆粒發(fā)揮藥效，細(xì)胞膜涂層有紅細(xì)胞、白細(xì)胞等，起到遞送、保護(hù)和靶向作用。雖然仿生納米顆粒載體具有諸多優(yōu)勢，但其制備技術(shù)不完善，潛在毒性研究不全面，仍需對其進(jìn)行全面的安全性評估。

聚合物納米顆粒載體的構(gòu)成結(jié)構(gòu)為陽離子聚合物、樹枝狀聚合物或多糖聚合物，具有生物相容性好、可降解等特點。mRNA分子在靜電吸引和疏水相互作用的幫助下與陽離子聚合物形成較為穩(wěn)定的多聚體[29]。仿生納米顆粒具有較好的生物相容性，較低的免疫原性，作為mRNA藥物遞送載體極具潛力，但其制備工藝復(fù)雜，應(yīng)充分考慮其潛在的不良反應(yīng)。

2mRNA藥物載體臨床前評價研究

對于mRNA藥物載體的臨床前安全性評估應(yīng)充分考慮其在生物體內(nèi)的分布、組織器官的蓄積以及對免疫系統(tǒng)的影響。

2.1 生物分布

mRNA藥物載體的生物分布研究是評估藥物安全性的重要環(huán)節(jié)，對于探究其對不同組織、器官的影響有著重要的意義。常用的生物分布研究技術(shù)有熒光素酶標(biāo)記法、同位素標(biāo)記法、定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)和分支鏈DNA信號放大技術(shù)(bDNA)。熒光素酶標(biāo)記法通過將編碼熒光素酶的LNP注射入小鼠體內(nèi)，通過活體成像技術(shù)可以實時監(jiān)測其在小鼠內(nèi)的分布過程。BioNTech公司/Pfizer公司研發(fā)的新冠病毒疫苗BNT162b2采用活體成像法檢測mRNA在體內(nèi)的分布，通過將包裹熒光素酶mRNA的LNP注射入小鼠體內(nèi)進(jìn)行生物分布研究，給藥后6h在注射部位和肝臟中均檢測到熒光，48h后肝臟中無法檢測到熒光表達(dá)。LNP常通過同位素標(biāo)記法進(jìn)行體內(nèi)分布研究，采用放射性[3H]標(biāo)記LNP，該脂質(zhì)標(biāo)記物不會和細(xì)胞脂質(zhì)交換，也不會被代謝。疫苗BNT162b2的LNP通過同位素試驗進(jìn)行分布檢測，研究發(fā)現(xiàn)給藥后在注射部位、血漿和大部分組織內(nèi)均可檢測到放射性，主要分布在肝臟、腎上腺、脾臟和卵巢。分支鏈DNA信號放大技術(shù)也是評估藥物在體內(nèi)分布的重要工具，取給藥后小鼠各組織器官，采用bDNA法檢測mRNA藥物的含量，與活體成像技術(shù)相結(jié)合能夠較為全面地分析藥物在各組織器官的含量。Moderna公司研發(fā)的新冠病毒疫苗mRNA-1273采用bDNA法進(jìn)行生物分布研究，給藥后2h在大鼠的腦、心臟、肺臟、眼球、睪丸等組織均檢測到了mRNA分布。

2.2 免疫原性和免疫毒性

mRNA藥物載體的免疫原性是其安全性評價中的另一個關(guān)鍵因素。由于mRNA藥物載體中陽離子脂質(zhì)和PEG化脂質(zhì)具有免疫原性，能夠引起細(xì)胞免疫與體液免疫，過強的免疫反應(yīng)可能會產(chǎn)生免疫毒性，因此對其進(jìn)行免疫原性的評估對于預(yù)測免疫相關(guān)不良反應(yīng)有著重要的作用。常用的檢測藥物免疫原性的試驗有抗藥抗體檢測、血液T細(xì)胞淋巴亞群分布等。常用的試驗技術(shù)為酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa)、流式細(xì)胞術(shù)。Nicolas Vabret團隊采用流式細(xì)胞術(shù)評估T細(xì)胞免疫效應(yīng)，研究人員在接種mRNA疫苗小鼠的外周血和脾臟樣本中檢測到了CD8+T細(xì)胞，表明了該疫苗能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[30]。

2.3 一般毒性

mRNA藥物的一般毒性檢查主要為重復(fù)給藥毒性實驗。試驗檢查項目包含臨床癥狀觀察、注射部位觀察、體重、攝食量、眼科學(xué)、血液學(xué)、尿液分析、凝血功能、組織病理學(xué)檢測等，對于非人靈長類動物還可檢測其體溫、血壓、心電圖等指標(biāo)。疫苗BNT162b2的臨床前安全性評估研究中[31]，試驗采取重復(fù)給藥的方式，每周給雄性和雌性Wistar Han大鼠肌肉注射疫苗1次，共3劑，劑量設(shè)置為30和100μg。該研究檢測了體重、體溫、注射部位、視力、聽覺、血液學(xué)、凝血功能等指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)接種疫苗后24h內(nèi)大鼠平均體重較輕，恢復(fù)階段對體重?zé)o明顯影響; 給藥后4和24h大鼠的體溫較高; 注射部位可觀察到局部反應(yīng)，出現(xiàn)輕微的紅斑與水腫，且呈劑量依賴性; 血液學(xué)檢測結(jié)果顯示白細(xì)胞升高，包含中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞; 組織病理學(xué)結(jié)果顯示脾臟重量增加、其余器官無明顯變化。Ndeupen等[32]研究表明，肌肉注射mRNA藥物會導(dǎo)致注射部位產(chǎn)生局部炎癥如水腫及紅斑，該不良反應(yīng)主要為LNP中陽離子脂質(zhì)固有炎癥特性導(dǎo)致。當(dāng)mRNA藥物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)遞送至全身時會產(chǎn)生各種不良反應(yīng)，最為常見的是疼痛、腫脹、發(fā)熱，這些不良反應(yīng)主要是由IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。因此，在其他種屬動物體內(nèi)進(jìn)行陽離子脂質(zhì)的促炎作用研究，深入解析其促炎作用通路，對LNP載體優(yōu)化、推動藥物臨床轉(zhuǎn)化具有重要指導(dǎo)意義。

3結(jié)語

目前，mRNA藥物在應(yīng)對突發(fā)性傳染性疾病、治療腫瘤等領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展，展現(xiàn)出極高的發(fā)展和應(yīng)用潛力。相較于傳統(tǒng)藥物，mRNA藥物的核心優(yōu)勢在于研發(fā)周期短，能夠迅速應(yīng)對新型病原體; 藥物安全性較高，不會整合進(jìn)入基因，通過在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成功能蛋白發(fā)揮療效。但mRNA藥物仍存在安全性風(fēng)險，特別是mRNA藥物遞送系統(tǒng)中的成分，如PEGs、陽離子脂質(zhì)、無機離子等，可能會導(dǎo)致炎癥、肝腎損傷、過敏等不良反應(yīng)。尚未有全面、系統(tǒng)和公認(rèn)的mRNA藥物的評價技術(shù)體系，現(xiàn)有的評價技術(shù)和方法不能夠準(zhǔn)確反映mRNA藥物在體內(nèi)的真實情況，對于藥物的分布、代謝、潛在毒性效應(yīng)等關(guān)鍵信息需要進(jìn)行進(jìn)一步挖掘。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和對mRNA藥物載體毒性機制研究的深入，未來將構(gòu)建出一套科學(xué)系統(tǒng)的評價體系，實現(xiàn)對mRNA藥物進(jìn)行全面的安全性評估，推動mRNA藥物臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。