在液相色譜（HPLC）分析中，保留時(shí)間的穩(wěn)定性直接決定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。但不少實(shí)驗(yàn)人員常會(huì)遇到這樣的難題：保留時(shí)間沿單一方向持續(xù)漂移——要么逐漸提前，要么不斷延后，不僅影響峰形積分，還可能導(dǎo)致定性結(jié)果偏差。今天，我們就從色譜柱、流動(dòng)相、儀器硬件、樣品四大核心維度，拆解保留時(shí)間漂移的深層原因，并給出一套高效排查方案，幫你快速找回穩(wěn)定的保留時(shí)間！
一、先搞懂：保留時(shí)間漂移的4大類(lèi)核心誘因
保留時(shí)間漂移并非隨機(jī)發(fā)生，其根源多與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中關(guān)鍵部件的性能變化或操作細(xì)節(jié)疏漏相關(guān)，具體可歸為以下四類(lèi)：
（一）色譜柱：保留行為的“核心載體”，出問(wèn)題最易漂移
色譜柱是樣品與流動(dòng)相發(fā)生相互作用的核心場(chǎng)所，其性能改變是保留時(shí)間漂移的首要誘因，常見(jiàn)問(wèn)題有4種：
1.平衡不充分：“沒(méi)準(zhǔn)備好就上崗”
新柱啟用、更換流動(dòng)相后，若未用足夠體積的流動(dòng)相平衡色譜柱，固定相與流動(dòng)相無(wú)法達(dá)到熱力學(xué)平衡，
保留行為會(huì)持續(xù)變化。尤其當(dāng)流動(dòng)相中含離子對(duì)試劑（如十二烷基硫酸鈉）、緩沖鹽（如磷酸鹽）時(shí)，平衡時(shí)間需延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)甚至過(guò)夜——若平衡時(shí)間不足，離子對(duì)試劑無(wú)法充分吸附在反相柱表面，會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間逐漸延后。
2.固定相流失：“柱效慢慢被消耗”
硅膠基質(zhì)色譜柱（如C18、C8）的鍵合相易在極端條件下水解流失：當(dāng)流動(dòng)相pH超出2~8范圍、水相比例過(guò)高（如>90%），或使用單官能團(tuán)、短鏈鍵合相時(shí)，水解速度會(huì)顯著加快。固定相流失會(huì)直接導(dǎo)致柱容量下降，樣品與固定相的相互作用減弱，最終表現(xiàn)為保留時(shí)間逐漸提前。
3.色譜柱污染：“活性位點(diǎn)被占滿”
樣品基質(zhì)中的大分子（如血清蛋白、食品中的淀粉）、流動(dòng)相中的微生物、儀器磨損產(chǎn)生的顆粒，都會(huì)吸附在色譜柱填料表面，占據(jù)固定相的活性位點(diǎn)。隨著污染加重，保留性能持續(xù)改變，同時(shí)還會(huì)伴隨柱壓逐漸升高的現(xiàn)象。
4.疏水坍塌：“固定相‘蜷縮’不工作”
小孔徑（<10nm）、端基封尾良好的反相柱（如C18），若長(zhǎng)期使用接近100%水相的流動(dòng)相（如純水），固定相的疏水鏈會(huì)因失去有機(jī)溶劑的“潤(rùn)濕”作用而卷曲收縮，導(dǎo)致樣品無(wú)法與固定相有效結(jié)合，保留時(shí)間會(huì)突然大幅提前，甚至出現(xiàn)“不保留”的情況。
（二）流動(dòng)相：保留行為的“調(diào)控劑”，細(xì)微變化也致命
流動(dòng)相的組成、性質(zhì)直接影響樣品與固定相的相互作用，哪怕微小變化也可能引發(fā)保留時(shí)間漂移，主要問(wèn)題有3類(lèi)：
5.組成比例偏差：“溶劑配比‘偷偷變’”
含甲醇、乙腈等易揮發(fā)溶劑的流動(dòng)相，若長(zhǎng)時(shí)間敞口放置或循環(huán)使用，有機(jī)相會(huì)因揮發(fā)導(dǎo)致比例降低、水相比例升高，最終使保留時(shí)間延后；此外，手動(dòng)配制流動(dòng)相時(shí)，若有機(jī)相或緩沖鹽的體積量取誤差超過(guò)1%，也會(huì)直接導(dǎo)致保留時(shí)間偏離預(yù)期。
6.流動(dòng)相污染：“雜質(zhì)‘悄悄’傷柱子”
水相流動(dòng)相若未經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，或在室溫下放置超過(guò)24小時(shí)，易滋生微生物；流動(dòng)相中的有機(jī)雜質(zhì)（如試劑中的殘留污染物）也會(huì)逐漸富集到色譜柱上，改變固定相的保留性能，間接引發(fā)保留時(shí)間漂移。
7.pH值失控：“酸堿環(huán)境‘超范圍’”
緩沖鹽流動(dòng)相的pH值若超出色譜柱推薦的使用范圍（多數(shù)硅膠柱為2~8），不僅會(huì)加速固定相水解，還可能改變樣品的解離狀態(tài)（如酸性樣品在高pH下解離增強(qiáng)），進(jìn)而導(dǎo)致保留時(shí)間持續(xù)變化。
（三）儀器硬件：保留行為的“支撐者”，穩(wěn)定性決定成敗
儀器部件的穩(wěn)定性直接影響流動(dòng)相的輸送、柱溫的控制，任何硬件故障都可能導(dǎo)致保留時(shí)間漂移，問(wèn)題集中在4個(gè)關(guān)鍵部件：
8.溫度不穩(wěn)定：“柱溫‘忽高忽低’”
保留時(shí)間對(duì)溫度極為敏感——柱溫每升高1℃，保留時(shí)間通常會(huì)縮短1%~2%。若柱溫箱故障（如溫度顯示與實(shí)際不符、控溫精度超±0.5℃），或儀器置于空調(diào)直吹、陽(yáng)光直射的位置（環(huán)境溫度波動(dòng)傳遞給柱溫箱或流動(dòng)相），都會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間隨溫度變化而漂移。
9.流速波動(dòng)：“流動(dòng)相‘時(shí)快時(shí)慢’”
泵內(nèi)存在氣泡會(huì)導(dǎo)致流速忽快忽慢，壓力曲線出現(xiàn)波動(dòng)，保留時(shí)間也會(huì)隨之忽前忽后；泵的單向閥寶石球磨損會(huì)造成流動(dòng)相倒流，實(shí)際流速降低，保留時(shí)間逐漸延后；泵密封墊老化則會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相滲漏，同樣使實(shí)際流速下降，保留時(shí)間延后。
10.比例閥/混合器故障：“溶劑混合‘不均勻’”
四元泵的比例閥若出現(xiàn)堵塞或校準(zhǔn)偏差，會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相比例不準(zhǔn)（如設(shè)定有機(jī)相30%，實(shí)際僅25%）；混合器堵塞或攪拌功能下降，則會(huì)造成流動(dòng)相混合不均，形成“梯度滯后”，兩種情況都會(huì)引發(fā)保留時(shí)間漂移。
11.吸濾頭堵塞：“流動(dòng)相‘抽不上來(lái)’”
流動(dòng)相瓶中的吸濾頭若被雜質(zhì)堵塞（如微生物、未溶解的緩沖鹽顆粒），會(huì)阻礙流動(dòng)相的正常抽取，導(dǎo)致泵的實(shí)際輸出流速降低，保留時(shí)間逐漸延后。
（四）樣品：保留行為的“研究對(duì)象”，自身問(wèn)題也添亂
樣品自身的純度、進(jìn)樣量若不符合要求，會(huì)間接影響色譜柱性能，導(dǎo)致保留時(shí)間漂移，主要有2種情況：
12.樣品污染：“強(qiáng)保留組分‘黏住’柱子”
樣品中的強(qiáng)保留雜質(zhì)（如中藥提取液中的鞣質(zhì)、環(huán)境水樣中的腐殖酸）會(huì)牢牢吸附在色譜柱填料上，無(wú)法被流動(dòng)相洗脫，長(zhǎng)期積累會(huì)逐漸改變固定相的保留性能。這類(lèi)問(wèn)題需通過(guò)固相萃?。⊿PE）、液液萃取等前處理手段去除樣品基質(zhì)，減少對(duì)色譜柱的污染。
13.樣品超載：“柱子‘吃不消’”
當(dāng)進(jìn)樣量超出色譜柱的最大柱容量（通常為柱體積的1%~2%）時(shí)，樣品與固定相的相互作用會(huì)達(dá)到飽和，部分樣品分子無(wú)法有效結(jié)合，導(dǎo)致保留時(shí)間提前，同時(shí)還會(huì)伴隨峰形展寬、拖尾的現(xiàn)象。
二、超實(shí)用：5步排查法，快速定位漂移原因
遇到保留時(shí)間漂移時(shí)，無(wú)需盲目排查，按以下步驟逐一驗(yàn)證，可高效找到問(wèn)題根源：
第1步：優(yōu)先檢查色譜柱平衡狀態(tài)
●確認(rèn)是否更換過(guò)流動(dòng)相或新啟用色譜柱，若有，需核實(shí)平衡時(shí)間是否足夠（常規(guī)流動(dòng)相需10~20倍柱體積，含離子對(duì)試劑需延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)）；
●操作：繼續(xù)用當(dāng)前流動(dòng)相沖洗色譜柱30分鐘，觀察后續(xù)進(jìn)樣的保留時(shí)間是否穩(wěn)定，若穩(wěn)定則為平衡不充分導(dǎo)致。
第2步：檢查流動(dòng)相的“正確性”
●核實(shí)流動(dòng)相組成：用移液管重新量取有機(jī)相、水相，確認(rèn)比例是否與方法一致；
●檢查pH值：用pH計(jì)測(cè)定緩沖鹽流動(dòng)相的實(shí)際pH，看是否在方法規(guī)定范圍內(nèi)；
●判斷是否污染：觀察流動(dòng)相是否出現(xiàn)渾濁、絮狀物（微生物污染特征），或聞是否有異味（有機(jī)相變質(zhì)），若有則需重新配制流動(dòng)相。
第3步：驗(yàn)證儀器硬件穩(wěn)定性
●柱溫：查看柱溫箱顯示溫度與設(shè)定值是否一致，記錄30分鐘內(nèi)的溫度波動(dòng)，若波動(dòng)超±0.5℃，需檢修柱溫箱；
●流速：觀察泵的壓力曲線是否平穩(wěn)，若壓力波動(dòng)超過(guò)5%，需排除泵內(nèi)氣泡（通過(guò)排氣閥排氣）、檢查單向閥；
●吸濾頭：將吸濾頭取出，用甲醇超聲清洗10分鐘，重新安裝后觀察流速是否恢復(fù)，若恢復(fù)則為吸濾頭堵塞。
第4步：評(píng)估色譜柱的“健康狀況”
●柱壓：對(duì)比當(dāng)前柱壓與新柱時(shí)的柱壓，若升高超過(guò)30%，說(shuō)明色譜柱可能污染，需用強(qiáng)溶劑沖洗（如反相柱用甲醇-水=90:10沖洗）；
●柱效：進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品（如萘、苯乙酮），計(jì)算理論塔板數(shù)，若柱效較新柱下降超過(guò)20%，說(shuō)明固定相可能流失，需更換色譜柱。第5步：排查樣品問(wèn)題
●樣品純度：取少量樣品，通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾后重新進(jìn)樣，若保留時(shí)間穩(wěn)定，說(shuō)明樣品中含顆粒雜質(zhì)，需優(yōu)化前處理步驟；
●進(jìn)樣量：減少50%進(jìn)樣量后重新分析，若保留時(shí)間恢復(fù)，說(shuō)明存在樣品超載問(wèn)題，需降低進(jìn)樣量至柱容量范圍內(nèi)。
三、小提醒：日常維護(hù)，減少漂移概率
想要從源頭減少保留時(shí)間漂移，日常操作中需注意3點(diǎn)：
14.色譜柱：避免超pH、超流速使用，每次實(shí)驗(yàn)后用合適溶劑沖洗（如反相柱用甲醇封存）；
15.流動(dòng)相：現(xiàn)配現(xiàn)用，水相流動(dòng)相需冷藏保存且不超過(guò)24小時(shí)，所有流動(dòng)相均需過(guò)濾、脫氣；
16.儀器：定期校準(zhǔn)柱溫箱、泵流速，每月清洗吸濾頭、單向閥，確保硬件處于穩(wěn)定狀態(tài)。保留時(shí)間漂移雖常見(jiàn)，但只要掌握“原因分類(lèi)+分步排查”的思路，就能快速定位問(wèn)題，讓液相色譜分析更高效、數(shù)據(jù)更可靠。
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