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摘 要： 建立了高效液相色譜測定道地產(chǎn)區(qū)金銀花藥材指紋圖譜及化學(xué)模式識別分析方法。采用Phenomenex Synergi Hydro-RP80 A 色譜柱（250 mm ×4.6 mm，4 μm），柱溫為25°C，梯度洗脫以流量為1.0 mL/min的乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，檢測波長為327nm，建立25批不同產(chǎn)地金銀花藥材的指紋圖譜，并用聚類分析和主成分分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)研究方法以及《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統(tǒng)》（2012年版）對25批金銀花樣品進(jìn)行質(zhì)量分析，標(biāo)示了13個共有峰，指認(rèn)了其中的6個共有峰，25批金銀花樣品中有88%的樣品相似度大于0.91。對25批三大道地產(chǎn)區(qū)的金銀花樣品進(jìn)行的聚類分析和主成分分析，結(jié)果顯示A與B產(chǎn)區(qū)的金銀花藥材的成分均一性總體低于C產(chǎn)區(qū)的金銀花藥材，同時研究了金銀花與山銀花的混淆區(qū)分，為金銀花的摻偽鑒別提供參考。該方法可對金銀花藥材內(nèi)在質(zhì)量做出評價，進(jìn)一步加強(qiáng)了金銀花藥材的質(zhì)量控制，為藥材的鑒別、品質(zhì)評價、市場規(guī)范、中藥制劑安全性、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化等方面提供重要的理論基礎(chǔ)。

 

關(guān)鍵詞： 金銀花藥材； 指紋圖譜； 化學(xué)模式識別； 質(zhì)量控制； 相似度評價

 

金銀花始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]。作為國家管理的38種名貴中藥材之一的金銀花，其葉、莖、花均可入藥，尤其以花藥效最強(qiáng)[2]。金銀花具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫、保肝、止血等功效[3?11]，主產(chǎn)于山東、河南、河北[12]。金銀花藥材現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于2020年版《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）一部[13]，僅以綠原酸一種成分做薄層色譜法定性鑒別，研究表明金銀花中含有包括有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜苷類等多種化學(xué)成分[14?17]，金銀花藥材的質(zhì)量控制常用方法有高效液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳及高相液相質(zhì)譜聯(lián)用法等[18?19]，測定成分多集中于《中國藥典》要求的兩類化合物。我國中醫(yī)藥的發(fā)展尤其重視道地藥材，目前的研究多存在樣品產(chǎn)地單一不具代表性，不足以反映我國幾大道地產(chǎn)區(qū)現(xiàn)狀等問題[20]。同時由于山銀花價格遠(yuǎn)低于金銀花，市場上金銀花與山銀花等互混、互代的現(xiàn)象十分嚴(yán)重[21?22]，這種現(xiàn)象不同程度地影響了中藥制劑的療效。筆者建立了一個更加科學(xué)穩(wěn)定的金銀花藥材高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統(tǒng)》軟件和SIMCA-P 14.1及SPSS軟件分析，對我國三大道地產(chǎn)區(qū)的25批金銀花藥材進(jìn)行進(jìn)行質(zhì)量評價，同時利用該指紋圖譜與山銀花做了混偽品區(qū)分，是能夠全面地反映金銀花整體質(zhì)量的綜合分析方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究提供科學(xué)依據(jù)。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1260型，配有G1315C型二極管陣列檢測器，安捷倫科技(中國)有限公司。

電子分析天平：AE240型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多（上海）有限公司。

電熱鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9070MBE型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

高速粉碎機(jī)：800Y型，永康市鉑歐五金制品有限公司。

超聲波清洗器：KQ-100DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

綠原酸、木犀草苷對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.3%、94.9%，批號分別為110753-202119、11720-202111，中國食品藥品檢定研究院。

異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、新綠原酸對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98.0%，批號分別為J0202AS、D1018AS、D0507AS、N0805AS，大連美侖生物技術(shù)有限公司。

乙腈、甲醇：均為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

磷酸：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

實(shí)驗(yàn)用25份金銀花，均經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院路金才教授鑒定為忍冬科植物忍冬的干燥花，藥材來源信息見表1。

表1   金銀花樣品來源

Tab. 1   Sources of honeysuckle samples

 

1.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP80A柱(250 mm × 4.6 mm，4 µm，美國飛諾美公司)；流動相：A相為乙腈，B相為0.1%磷酸溶液，流量為1.0 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：25°C；進(jìn)樣體積：10 µL；洗脫方式：梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2。

表2   梯度洗脫程序

Tab. 2   Gradient elution procedure

 

1.3 溶液配制

金銀花樣品溶液：按四分法取適量金銀花的干燥花，用高速粉碎機(jī)粉碎成粗粉，混勻。稱取過篩（孔徑為0.25 mm）后的樣品粉末約0.50 g于具塞錐形瓶中，用移液管加入70%甲醇溶液25.00 mL，用天平稱重并記錄，經(jīng)超聲波處理（功率為250 W，頻率為35 kHz）40 min，冷卻，再次于天平稱重并記錄。緩慢地用70%甲醇補(bǔ)充減少的質(zhì)量，直至與上次質(zhì)量相當(dāng)，混勻后用0.22 μm的微孔濾膜過濾。精密量取續(xù)濾液3.00 mL，置10.00 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至標(biāo)線，混勻。混合對照品溶液：分別精密稱取適量的異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、新綠原酸、木犀草苷、綠原酸對照品于10.00 mL容量瓶中，加入甲醇定容至標(biāo)線，混勻，得6種對照品質(zhì)量濃度分別為0.66、0.085、0.148、0.164、0.243、2.89 mg/mL的混合溶液?？瞻兹軇喝∷鳛榭瞻兹軇?/span>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取金銀花樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。將25批樣品的色譜圖導(dǎo)入 《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），進(jìn)行相似度評價。采用SIMCA-P 14.1及SPSS軟件對25批樣品進(jìn)行主成分分析及聚類分析。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

《中國藥典》（2020版）中指出金銀花中綠原酸、木犀草苷最大檢測波長分別為327、350 nm。金銀花中含多種化學(xué)成分，需同時對多種成分進(jìn)行分析，故利用二極管陣列檢測器對6種對照品進(jìn)行全波長掃描，全波長紫外吸收光譜如圖1所示。

圖1   6 種對照品的紫外線吸收光譜

Fig. 1   UV absorption spectrum of 6 controls

從圖1可以看出，在327 nm波長附近，新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草苷6種成分均有明顯吸收，且各目標(biāo)成分的色譜峰分離度良好，因此最終選擇327 nm作為檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇

因金銀花藥材的多種功效成分大多具有較高的極性，同時參考《中國藥典》2020版一部“金銀花”項(xiàng)下的含量測定方法進(jìn)行流動相的考察[13]?？疾飚?dāng)有機(jī)相分別為乙腈、甲醇時，6種成分的色譜峰面積、分離度及峰形。結(jié)果表明，選取乙腈為有機(jī)相時，各成分的峰形和分離度更優(yōu)，因此選用乙腈為有機(jī)相。考察水相分別為純水、0.1%甲酸溶液、0.3%甲酸溶液、0.1%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液時，6種成分的峰面積、分離度及峰形。結(jié)果表明，加入磷酸后，各成分經(jīng)色譜柱分離后峰形更好，分離度更高，且0.2%磷酸溶液和0.1%磷酸溶液分離效果無明顯差別，考慮到色譜柱的耐酸性有限，酸性過強(qiáng)會對色譜柱造成損害，所以最終選擇水相為0.1%磷酸溶液。

2.1.3 色譜柱的選擇

選用Agilent 1260和WATER 2489兩套HPLC系統(tǒng)，分別用Phenomenex Synergi Hydro-RP80A柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）、InfinityLabPoroshell 120 EC-C18柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）、Accucore™ XL C18柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）3種均以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱進(jìn)行考察。結(jié)果表明，不同色譜系統(tǒng)、不同色譜柱對金銀花樣品各成分保留時間和分離度影響較小。參考文獻(xiàn)[23?24]的研究成果，分別考察色譜柱填充粒徑為4、5 µm的色譜柱時6種成分的峰面積、峰形以及分離度。結(jié)果表明，使用5 µm粒徑的色譜柱時，綠原酸與木犀草苷等成分分離效果并不理想，使用粒徑為4 µm的色譜柱分離效果更好，各成分色譜峰面積更大，且峰形更佳。綜合考慮，色譜柱選擇Phenomenex Synergi Hydro-RP80A柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）。

2.2 金銀花藥材指紋圖譜

2.2.1 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

移取25批金銀花樣品粉末適量，按照1.3方法制備樣品溶液，再按照1.2色譜條件進(jìn)樣，記錄其HPLC指紋圖譜，A、B、C 3個產(chǎn)區(qū)的金銀花HPLC指紋圖譜如圖2所示。

圖2   不同產(chǎn)區(qū)金銀花HPLC指紋圖譜

Fig. 2   HPLC fingerprint of Lonicera japonica Thunb from different habitats

將25批樣品的HPLC色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），對25批金銀花樣品的特征指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算。首先以S24號金銀花樣品溶液的特征圖譜作為參照圖譜，以中位數(shù)法作為生成對照特征圖譜的方法，設(shè)定時間窗寬度為0.1 min，生成對照特征圖譜作為金銀花的特征圖譜。將參照譜圖（S24號）的保留時間和峰面積記為1，計(jì)算不同產(chǎn)地金銀花樣品各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，利用“相關(guān)系數(shù)”法計(jì)算各金銀花全圖譜的相似度，參與共有模式建立的25個金銀花樣品的HPLC指紋圖譜如圖3所示。

圖3   25個金銀花樣品的HPLC指紋圖譜

Fig. 3   HPLC fingerprint of 25 honeysuckle samples

1~13—共有色譜峰

2.2.2 共有峰的指認(rèn)及歸屬

根據(jù)圖3相似度評價系統(tǒng)給出的共有峰是13個，將13個共有峰作為金銀花指紋圖譜的穩(wěn)定特征峰，利用對照品進(jìn)行特征峰的指認(rèn)，將6種對照品的混合溶液按照1.2色譜條件進(jìn)樣分析，金銀花中 6 種成分的保留時間見表3。由表3可知，通過比對色譜保留時間，確定3、4、9、10、11和13號峰分別為新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C。

表3   金銀花中 6 種成分的保留時間

Tab. 3   Retention time of 6 components in honeysuckle

 

2.2.3 指紋圖譜重復(fù)性試驗(yàn)

按1.3方法制備樣品溶液，將同一金銀花樣品制備成6份樣品溶液，按照1.2色譜條件進(jìn)樣，以共有峰11號（異綠原酸A）為參照峰，記錄相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表4。由表4可知，各共有峰相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.0%，相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，證明所建立的高效液相特征圖譜具有良好的重復(fù)性。

表4   金銀花藥材指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果（n=6）

Tab. 4   Methodological validation results of fingerprinting of honeysuckle medicinal materials (n=6) ( % )

 

2.2.4 指紋圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照1.2色譜條件，將同一樣品溶液分別于制備后0、4、8、12、24、48 h內(nèi)進(jìn)樣，以共有峰11號（異綠原酸A）為參照峰，記錄各共有峰的保留時間和峰面積，結(jié)果見表4。由表4可知，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于2.0%，說明所建立的高效液相特征圖譜在48 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.5 指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），以25批金銀花藥材樣品的HPLC指紋圖譜生成的對照指紋圖譜為參照，進(jìn)行整體相似度評價，分析結(jié)果見表5。對表5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)可知，88%的金銀花樣品與對照特征圖譜的相似度大于0.91，表明相似的化學(xué)成分存在于這些不同批次的樣本中。其中，S1、S15、S16樣品的相似度低于其他批次樣品，說明這幾批樣品質(zhì)量可能存在問題。

表5   金銀花相似性分析

Tab. 5   Analysis of honeysuckle similarity

 

2.3 化學(xué)模式識別分析

2.3.1 聚類分析

應(yīng)用SPSS 21.0.0.0軟件對25批金銀花樣品指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，以色譜峰面積百分比（PPA）數(shù)據(jù)展開，采用平均聯(lián)接（組間）法，以夾角余弦法為相似度測度進(jìn)行聚類分析，金銀花的聚類譜系圖如圖4所示。

圖4   金銀花的聚類譜系圖

Fig. 4   Cluster pedigree of honeysuckle

通過聚類分析，25批金銀花樣品被分為兩大類，分類結(jié)果見表6。

表6   聚類分析分類結(jié)果

Tab. 6   Result of classification by cluster analysis

 

2.3.2 主成分分析

利用SIMCA-P 14.1及SPSS軟件分析對25批樣品進(jìn)行主成分分析，選擇偏最小二乘辨別（PLS-DA）進(jìn)行分析，主成分分析結(jié)果見表7。由表7可知，當(dāng)選取3個主成分時，累積貢獻(xiàn)率為84.1%，可體現(xiàn)變量中大部分信息，且R2Y為0.834，Q2為0.637，通常R2Y、Q2數(shù)值接近1，說明模型穩(wěn)定，當(dāng)兩者高于0.5時，說明該模型預(yù)測能力好。

表7   主成分分析特征值

Tab. 7   Characteristic value of PCA

 

對PLS-DA的得分圖進(jìn)行分析，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表不同樣品在主成分PC1和PC2上投影的得分值，25批樣品PCA得分圖如圖5所示。從圖5可以看出，S19樣品已經(jīng)不在95%的置信區(qū)間內(nèi)，表明該模型對此樣品無法進(jìn)行較好分析。距離橫坐標(biāo)或者縱坐標(biāo)的零點(diǎn)較近的樣品對該主成分的貢獻(xiàn)值較小，反之則較大。得分圖將25份樣品分成兩組，紅色方形的樣品位置相對較近，被分成第一類樣品；黑色方塊的樣品位置相對較遠(yuǎn)，被分為第二類。

圖5   25批樣品PCA得分圖

Fig. 5   PCA score plot for 25 batches of samples

進(jìn)一步對PLS-DA的載荷圖進(jìn)行分析，載荷圖中每一個三角形代表一個共有峰，距離橫軸與縱軸原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)代表該成分權(quán)重值越大，在決定樣品區(qū)分中的作用越大，25批樣品PCA載荷圖如圖6所示。

圖6   25批樣品PCA載荷圖

Fig. 6   PCA load plot of 25 batches of samples

從圖6可以看出，峰8、峰11、峰13對不同批次樣品起到更加重要的區(qū)分作用。進(jìn)一步對模型的變量投影（VIP）進(jìn)行分析，通常以VIP值大于1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，說明該成分的貢獻(xiàn)較大，PCA各共有峰的VIP圖如圖7所示。從圖7可以看出，共得到貢獻(xiàn)相對較大的6個變量色譜峰，依次為峰11、峰8、峰13、峰6、峰10、峰5。

圖7   PCA各共有峰的VIP圖

Fig. 7   VIP plot of each peak shared by PCA

2.4 混淆品區(qū)分

自1977年開始，到2000年版《中國藥典》一直未將山銀花與金銀花作以區(qū)分，自2005版《中國藥典》才開始區(qū)分兩者。由于金銀花產(chǎn)量低、臨床藥用功效大且需求量逐年升高，如今市場上山銀花冒充金銀花的現(xiàn)象屢見不鮮。為了能夠準(zhǔn)確、快速將兩者區(qū)分，按1.3方法制備山銀花樣品溶液，在1.2色譜條件下測定。在327 nm的檢測波長下，綠原酸和異綠原酸峰面積過大、含量較高，導(dǎo)致其他成分間的差異表現(xiàn)不明顯，不能較好區(qū)分金銀花和山銀花；將檢測波長改為240 nm，得到的金銀花色譜圖和山銀花色譜圖差異明顯，二者可在240 nm波長下得到較好區(qū)分。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對金銀花和山銀花樣品在240 nm波長下得到的HPLC特征圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，用“相關(guān)系數(shù)”法計(jì)算金銀花和山銀花全圖譜的相似度為0.77，金銀花和山銀花得到較好地區(qū)分。金銀花和山銀花相似度譜圖如圖8所示。

圖8   金銀花和山銀花相似度譜圖

Fig. 8   Similarity chromatogram of honeysuckle and honeysuckle

S1—山銀花； S2—金銀花

t/min

 

3 結(jié)論

建立了測定金銀花藥材的高效液相色譜指紋圖譜法，得到能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖，采用該方法測定了25批不同產(chǎn)地金銀花藥材的指紋圖譜，對色譜條件和提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好；建立了金銀花指紋圖譜的共有模式，標(biāo)示了13個共有峰，指認(rèn)了其中的6個共有峰，并對指紋圖譜特征及其相關(guān)性進(jìn)行深入分析，25批金銀花樣品中有88%的樣品相似度大于0.91，3批相似度低于0.91的樣品均產(chǎn)自A產(chǎn)區(qū)。對25批三大道地產(chǎn)區(qū)的金銀花樣品進(jìn)行的聚類分析和主成分分析，結(jié)果顯示A與B產(chǎn)區(qū)的金銀花藥材的成分均一性總體低于C產(chǎn)區(qū)的金銀花藥材，建立的金銀花藥材的高效液相色譜指紋圖譜法能夠有效評估其功效成分的一致性及穩(wěn)定性，為其制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。探討了金銀花與山銀花的混淆區(qū)分問題，為金銀花的摻偽鑒別提供參考，進(jìn)一步加強(qiáng)了金銀花藥材的質(zhì)量控制，為藥材的鑒別、品質(zhì)評價、市場規(guī)范、中藥制劑安全性、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化等方面提供重要的理論基礎(chǔ)。

在金銀花藥材的指紋圖譜研究需結(jié)合多維度分析手段進(jìn)一步深入與細(xì)化研究，未來可通過擴(kuò)大樣本范圍進(jìn)一步考察不同采收期，不同種植條件，不同加工方式，不同貯存條件對金銀花藥材功效成分的影響，深入剖析金銀花藥材質(zhì)量差異的本質(zhì)原因，為未來金銀花藥材的高效種植提供理論支持和實(shí)踐指導(dǎo)。

 

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