妥布霉素（TOB）是黑暗鏈霉菌產生的次級代謝產物，具有水溶性好、抗菌活性高等特點，是臨床應用中最常用的氨基糖苷類抗生素之一，常用于治療敏感細菌引起的嚴重感染。在養(yǎng)殖業(yè)中，TOB既作為獸藥用于治療家禽、家畜腸炎和肺炎等疾病，又被添加至飼料中以提高動物存活率并促進生長，這導致TOB在水、土壤等環(huán)境及牛奶、雞蛋、羊肉等動物源性食品中逐漸積累，對人類健康構成潛在威脅。長期攝入含有過量TOB殘留的乳制品或肉制品，可能引發(fā)腎臟毒性反應、近曲小管上皮細胞損傷及胃腸道功能紊亂，因此亟需開發(fā)一種簡單、快速且高靈敏度的方法，用于測定動物源性食品中TOB的殘留量。歐盟委員會已制定了針對牛奶、禽肉、雞蛋等動物源性食品中氨基糖苷類抗生素的最大殘留限量，其中牛奶中TOB的最大殘留限量為200μg·kg−1。
目前，TOB 的常用檢測方法有微生物測定法、免疫分析法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法等，但都有一定不足之處。為克服上述方法的局限性，研究者開發(fā)了生物傳感器法（如比色法、電化學分析法、熒光光譜法）用于抗生素檢測。其中，熒光光譜法因操作簡單、靈敏度高和特異性好等優(yōu)點，廣泛應用于食品安全監(jiān)控及生物化學分析領域，該方法依賴于發(fā)光材料的光學性質。近年來，金屬納米簇、半導體納米材料、稀土上轉換納米粒子、石墨烯量子點（GQD）等發(fā)光材料被合成并應用于熒光光譜檢測，GQD是一種兼具量子限域效應、尺寸效應的準零維碳材料，具有良好的生物相容性、光學穩(wěn)定性和水溶性，是理想的光學探針。此外，通過調控石墨烯片尺寸、引入功能基團或摻雜雜原子，可有效調節(jié)GQD的光學性質，為開發(fā)特定需求的熒光探針提供便利。
研究人員通過一步法熱解L-半胱氨酸（L-Cys）、L-脯氨酸（L-Pro）和檸檬酸的混合物，制備了具有高熒光性能的氨基酸功能化 GQD（Cys-Pro-GQD），該量子點與氨基修飾的TOB適配體（Apt）連接形成Apt-Cys-Pro-GQD后，通過π-π堆疊作用與氧化石墨烯（GO）結合，構建了熒光適配體傳感器GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系。當樣品中存在 TOB時，TOB與GO對Apt-Cys-Pro-GQD的競爭性結合使得Apt-Cys-Pro-GQD從GO表面解吸（示意圖如圖1所示），熒光恢復，基于此，提出了熒光光譜法測定牛奶中TOB含量的方法，實現(xiàn)了對TOB的快速檢測。
part 1試驗方法
1.1 Cys-Pro-GQD的制備
取L-Pro、L-Cys和檸檬酸置于燒杯中，加入水，超聲至完全溶解，于加熱面板上加熱蒸干，再轉移至180℃烘箱中加熱3h，得到Cys-Pro-GQD粗產物，冷卻后加入水，用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.5左右，過濾膜，濾液用透析袋透析 24h（除去未反應的物質），于85℃真空干燥，即得到Cys-Pro-GQD。
1.2 Apt-Cys-Pro-GQD的制備
取Apt，離心，加入Tris-Mg-K緩沖液溶解，得到Apt溶液，于−20℃儲存?zhèn)溆?。取Cys-Pro-GQD，加入水，用磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（PBS）調節(jié) pH至5.0左右，加入EDC和NHS，振蕩，活化Cys-Pro-GQD中的羧基，再用PBS調節(jié)pH至7.0左右，加入處理過的全部Apt溶液，振蕩2h進行縮合反應，用透析袋透析24h，得到Apt-Cys-Pro-GQD，于4℃避光儲存?zhèn)溆谩?/span>
1.3 GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系的制備
取Apt-Cys-Pro-GQD置于離心管中，加入GO溶液和水，反應5min，得到GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系。
1.4 樣品的前處理以及TOB的檢測
稱取牛奶樣品置于螺旋離心管中，加入磷酸溶液、硫酸鋅溶液和三氟乙酸，用水定容，劇烈振蕩，離心，取上清液過濾膜。取濾液，加至GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系中，設 置 激發(fā)狹縫、發(fā)射狹縫寬度均為3.0nm，在激發(fā)波長350nm、發(fā)射波長440nm處檢測。
part 2結果與討論
2.1 合成材料的表征
試驗通過一步法熱解L-Cys、L-Pro 和檸檬酸，制備了Cys-Pro-GQD。檸檬酸通過分子間縮合及碳化過程，形成由 sp2碳原子構成的石墨烯片；作為功能分子的L-Cys和L-Pro，可改善GQD的催化活性與光學性質，通過石墨烯片邊緣的羧基與 L-Cys、L-Pro中的氨基發(fā)生縮合反應形成酰胺鍵，實現(xiàn)了GQD的功能化修飾。采用HRTEM、AFM、傅里葉紅外光譜儀對Cys-Pro-GQD進行表征，同時采用紫外-可見分光光度計對Apt、Cys-Pro-GQD、Apt-Cys-Pro-GQD進行表征，結果見圖2。
由圖2可知：在HRTEM圖中，Cys-Pro-GQD形貌呈現(xiàn)球形，尺寸約為10nm，并且出現(xiàn)了晶格間距為0.21nm 的石墨烯片晶格條紋，對應于石墨烯的(100) 晶面；在AFM圖中，Cys-Pro-GQD的厚度約為1nm，說明 Cys-Pro-GQD是由2~3層石墨烯片組成；在傅里葉紅外光譜圖中，3000~3500cm−1處的吸收峰對應N―H鍵對稱伸縮振動，3400cm−1處的吸收峰對應O―H鍵對稱振動，1695cm−1處的吸收峰對應C=O鍵伸縮振動，1599cm−1處的吸收峰歸屬于咪唑環(huán)骨架的伸縮振動，1385cm−1處的吸收峰對應CO―NH鍵伸縮振動，1198cm−1處的吸收峰對應O=C―鍵伸縮振動，說明Cys-Pro-GQD已制備成功；在紫外-可見吸收光譜圖中，Apt在260nm附近有特征吸收峰，與Cys-Pro-GQD相比，Apt-Cys-Pro-GQD在260nm處也存在特征吸收，說明Apt連接到Cys-Pro-GQD上，Apt-Cys-Pro-GQD制備成功。
2.2 Cys-Pro-GQD和Apt-Cys-Pro-GQD的熒光特性
試驗對Cys-Pro-GQD、Apt-Cys-Pro-GQD進行熒 光光譜分析，測得的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜見圖3。
由圖3可知：Cys-Pro-GQD的最大激發(fā)波長為340nm，最大發(fā)射波長為 430nm；Apt-Cys-Pro-GQD的最大激發(fā)波長為350nm，最大發(fā)射波長為440nm。與Cys-Pro-GQD相比，Apt-Cys-Pro-GQD的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長均紅移10nm，說明Apt連接到Cys-Pro-GQD上，Apt-Cys-Pro-GQD 制備成功。為了獲得Apt-Cys-Pro-GQD較強的熒光強度，試驗選擇350nm作為熒光檢測的激發(fā)波長，440nm作為熒光檢測的發(fā)射波長。在選定的波長下，Cys-Pro-GQD和Apt-Cys-Pro-GQD均表現(xiàn)出較強熒光性能，Apt的引入未對 Cys-Pro-GQD的熒光強度產生明顯影響，說明Apt-Cys-Pro-GQD可用于熒光光譜檢測。
2.3 GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系的工作機制
試驗基于GO與Apt-Cys-Pro-GQD 之間的熒光 共振能量轉移（FRET）原理，設計了熒光適配體傳感器GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系。當體系中無GO存在時，Apt-Cys-Pro-GQD在350nm激發(fā)波長下表現(xiàn)出較強熒光；當體系中GO存在時，GO的苯環(huán)結構與Apt之間通過 π-π堆疊作用形成的氫鍵，使Apt-Cys-Pro-GQD貼近GO薄層表面，GO的羥基或羧基與 Apt 的羥基或胺基通過增強結合力，促使能量從Apt-Cys-Pro-GQD 向GO轉移，導致 Apt-Cys-Pro-GQD的熒光被猝滅。當向GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系中加入目標物TOB時，TOB與GO對Apt-Cys-Pro-GQD的競爭性結合促使Apt-Cys-Pro-GQD從GO表面解吸，Apt-Cys-Pro-GQD熒光恢復。
2.4 熒光猝滅條件的選擇
試驗考察了不同GO質量濃度和反應時間對猝滅Apt-Cys-Pro-GQD熒光強度的影響，結果見圖4。
由圖4可知：隨著GO質量濃度增大，Apt-Cys-Pro-GQD的熒光強度呈逐漸下降趨勢，當GO質量濃度為100mg·L−1 時，Apt-Cys-Pro-GQD的熒光強度降低約80.0%；繼續(xù)增大GO質量濃度，Apt-Cys-Pro-GQD的熒光強度趨于平穩(wěn)。當反應時間為1min 時，Apt-Cys-Pro-GQD的熒光強度迅速降低83.0%；隨著反應時間延長，熒光強度趨于平穩(wěn)。綜合考慮檢測效率，試驗選擇的GO質量濃度為100mg·L−1，反應時間為5min。
2.5 特異性試驗
為了考察試驗的特異性，分別向 GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系中加入卡那霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素等干擾物質（干擾物質濃度為目標物TOB濃度的10倍），結果見圖5。
由圖5可知：當在GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系中加入干擾物質時，體系熒光強度未發(fā)生明顯變化，說明干擾物質不會改變GO對Apt-Cys-Pro-GQD的吸附，體系熒光仍然被猝滅；當在 GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系中加入 TOB時，由于TOB和Apt之間的特異性結合，使得Apt-Cys-Pro-GQD從GO的表面解吸下來，熒光恢復。因此，GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系具有良好的特異性。
2.6 標準曲線和檢出限
分別取TOB標準溶液系列加至GO/Apt-Cys-Pro-GQD體系中測定，以TOB濃度的對數(shù)值（Logc）為橫坐標，對應的熒光強度為縱坐標繪制標準曲線。 結果顯示，TOB濃度在50~ 5000nmol·L−1內其對數(shù)值與對應的熒光強度呈線性關系，線性回歸方程為y=50.21x+18.86，相關系數(shù)為0.9982。
按照試驗方法對空白樣品重復測定7次，計算標準偏差s，以3.143s計算檢出限，結果為10nmol·L−1。
2.7 精密度和回收試驗
按照試驗方法測定實際牛奶樣品中TOB的含量，結果顯示，牛奶樣品中未檢出TOB。對上述空白牛奶樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗，每個濃度水平平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標準偏差（RSD），同時采用GB/T 21323— 2007《動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定 高效液相色譜-質譜/質譜法》進行測定，結果見表1。
由表1可知：采用本方法檢測空白加標牛奶樣品時，TOB的回收率為90.9%~108%，測定值的RSD為1.6%~2.5%；采用 LC-MS/MS 檢測空白加標牛奶樣品時，TOB的回收率為 69.9%~100%，測定值的RSD為3.6%~6.6%，說明本方法的精密度和準確度良好。
2.8 方法比對
將本方法與文獻報道的TOB檢測方法進行比對，結果見表2。 由表2可知，本方法檢測范圍寬、靈敏度高，可用于實際牛奶樣品中TOB的檢測。
part 3試驗結論
本工作制備了氨基酸功能化的Cys-Pro-GQD，與Apt結合形成Apt-Cys-Pro-GQD，具有優(yōu)異的熒光性能。基于Apt-Cys-Pro-GQD與GO之間高效的FRET原理，提出了熒光光譜法測定牛奶樣品中TOB含量的方法。該方法具有特異性好、檢測范圍寬、靈敏度高的特點。
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