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摘 要： 建立了高效液相色譜測(cè)定聚谷氨酸鈉創(chuàng)面修復(fù)輔料中γ-聚谷氨酸鈉含量的方法。調(diào)節(jié)樣品的pH值來(lái)降低卡波姆在樣品中的溶解性，并通過(guò)離心的方式使卡波姆成分分離，排除其對(duì)測(cè)試的干擾，使樣品可以順利通過(guò)0.45 μm微孔膜過(guò)濾并完成進(jìn)樣。結(jié)果表明，γ-聚谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度在0.18～0.90 mg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 6，檢出限為18 μg/mL，定量限為45 μg/mL。測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.64%（n=6），樣品加標(biāo)回收率為96.43%～98.71%。該方法可用于含γ-聚谷氨酸鈉成分制劑的質(zhì)量控制，還可對(duì)含卡波姆的產(chǎn)品中卡波姆成分的分離提供參考。

 

關(guān)鍵詞： γ-聚谷氨酸鈉； 高效液相色譜法； 卡波姆； 透明質(zhì)酸鈉

 

創(chuàng)傷性創(chuàng)面是一種由車(chē)禍、燒燙、切割等各種致傷因素引起的皮膚和軟組織損傷。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年對(duì)創(chuàng)面治療有需要的患者可達(dá)數(shù)百萬(wàn)[1]。隨著對(duì)創(chuàng)面修復(fù)需求的劇增，配合創(chuàng)面治療使用的醫(yī)用創(chuàng)面修復(fù)敷料也越來(lái)越受到人們的青睞。

 

目前除了紗布、繃帶等傳統(tǒng)的敷料外，也涌現(xiàn)了一些新型敷料，例如水凝膠敷料、水膠體敷料、薄膜類(lèi)敷料、海藻酸鹽類(lèi)敷料、泡沫敷料等[2]。新型敷料相較于傳統(tǒng)敷料，在保持傷口位置的濕潤(rùn)，促進(jìn)傷口處細(xì)胞的再生與遷移及血管的生成等方面都有明顯的優(yōu)勢(shì)。創(chuàng)面修復(fù)敷料在創(chuàng)傷性創(chuàng)面治療過(guò)程中可以快速覆蓋傷口，從而提供臨時(shí)屏蔽幫助傷口抵御外部感染，同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞的增殖和遷移，加快皮膚組織的愈合[3]。隨著傷口護(hù)理理論的不斷發(fā)展，醫(yī)用創(chuàng)面敷料的種類(lèi)和功能也出現(xiàn)多樣化。γ-聚谷氨酸鈉有較好的水溶性、吸附性、保濕性、緩蝕性等，可作為保濕劑、絮凝劑、藥物載體、緩釋劑以及醫(yī)藥敷料等應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[4]。研究發(fā)現(xiàn)γ-聚谷氨酸鈉還具有促進(jìn)礦物吸收、生物膜形成、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化等一系列生物活性功能[5]?；谄湓诖龠M(jìn)皮膚修復(fù)方面的優(yōu)良性能，被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)敷料產(chǎn)品中[6?7]。為了強(qiáng)化產(chǎn)品在創(chuàng)傷性創(chuàng)面部位的修復(fù)效果，同時(shí)在產(chǎn)品中添加透明質(zhì)酸鈉、卡波姆等成分作為輔助。透明質(zhì)酸鈉不僅可以促進(jìn)傷口愈合還具有良好的生物安全性[8?9]。卡波姆具有乳化、助溶、助懸等重要作用[10?12]，可以有效提高制劑產(chǎn)品的膚感，給予使用者更好的使用體驗(yàn)。

 

目前，γ-聚谷氨酸鈉含量測(cè)定方法主要有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）比濁法[13]、高效液相色譜（HPLC）法（QBT 5189—2017 《γ-聚谷氨酸》）、紫外分光光度法[14]、水解法[15]、比色法[16?17]等。其中，CTAB比濁法、紫外分光光度法、比色法在測(cè)定γ-聚谷氨酸鈉含量時(shí)會(huì)被樣品中的其他輔料成分干擾；水解法操作過(guò)程較復(fù)雜，且水解條件比較嚴(yán)苛；液相色譜法不需要額外的化學(xué)反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，在含有γ-聚谷氨酸鈉的各類(lèi)制劑產(chǎn)品中普適性更好，易于在行業(yè)間傳播。

 

透明質(zhì)酸鈉和卡波姆等成分的添加，在提升產(chǎn)品性能的同時(shí)，也增大了準(zhǔn)確測(cè)定產(chǎn)品中 γ-聚谷氨酸鈉含量的難度。用原料檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)QBT 5189—2017 《γ-聚谷氨酸》中規(guī)定的液相色譜法測(cè)定γ-聚谷氨酸鈉含量時(shí)，卡波姆、透明質(zhì)酸鈉和原流動(dòng)相都會(huì)影響檢測(cè)。由于卡波姆的黏稠度很大，樣品無(wú)法通過(guò)微孔膜進(jìn)行過(guò)濾，導(dǎo)致無(wú)法直接進(jìn)樣?？ú匪z在pH 6～12中的溶液中最黏稠，當(dāng)pH小于3或大于12時(shí)黏度會(huì)降低[11]，筆者通過(guò)改變樣品的pH值的方式降低了卡波姆的黏稠度，使樣品中的卡波姆析出，并通過(guò)離心的方式將卡波姆與料液進(jìn)行了分離，除去卡波姆后的料液黏度明顯降低，使得樣品可以順利通過(guò)0.45 μm的微孔膜進(jìn)行過(guò)濾。標(biāo)準(zhǔn)中的流動(dòng)相并不適用于該產(chǎn)品，通過(guò)對(duì)不同流動(dòng)相的不斷嘗試，最終選擇了0.1 mol/L的氯化鈉溶液作為流動(dòng)相，此流動(dòng)相不僅可以使目標(biāo)物質(zhì)正常出峰且與相鄰峰（透明質(zhì)酸鈉的峰）可以有效分離，該方法可為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供有效參考。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 Infinity Ⅱ型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子分析天平：（1）MS12002TS/02型，感量為0.01 g；（2）ME204T/02型，感量為0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

渦旋混勻儀：MX-S型，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司。

大容量高速臺(tái)式離心機(jī)：CHT210R型，長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)有限公司。

超純水機(jī)：ULPHW-Ⅳ型，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

pH計(jì)：S210型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

濃乙酸、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

鹽酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

γ-聚谷氨酸鈉對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.2%，批號(hào)為20240306，山東福瑞達(dá)生物科技有限公司。

硫酸鈉溶液：0.3 mol/L，稱(chēng)取42.6 g無(wú)水硫酸鈉，加水溶解并定容至1 L，用濃乙酸逐滴加入調(diào)節(jié)pH值至4.0，用孔徑為0.22 μm的微孔膜過(guò)濾，超聲脫氣15 min。

醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠創(chuàng)面修復(fù)敷料樣品：批號(hào)分別為20240523、20240528、20240426，山東福瑞達(dá)生物股份有限公司。

樣品輔料：不含γ-聚谷氨酸鈉，其他成分與γ-聚谷氨酸鈉創(chuàng)面修復(fù)敷料樣品中成分一致，山東福瑞達(dá)生物股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，由ULPHW-Ⅳ型超純水機(jī)制得。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Shodex OHpak SB-804 HQ柱[300 mm× 8.0 mm，10 μm，力森諾科科學(xué)儀器（上海）有限公司]；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；進(jìn)樣體積：20 μL；流動(dòng)相：0.1 mol/L氯化鈉溶液，pH=4，流量為0.5 mL/min。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品制備

γ-聚谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：10.24 mg/mL，精密稱(chēng)取γ-聚谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，搖勻。

聚谷氨酸鈉創(chuàng)面修復(fù)敷料樣品溶液：精密移取醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠創(chuàng)面修復(fù)敷料樣品10 mL于50 mL移液管中，再緩慢加入50 μL的濃鹽酸，渦旋混勻后，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。分別精密量取離心后的上清液1 mL和流動(dòng)相1 mL，置于10 mL離心管中，充分振蕩均勻后，溶液經(jīng)0.45 μm微孔膜過(guò)濾。

空白輔料溶液：精密移取聚谷氨酸鈉創(chuàng)面修復(fù)敷料空白輔料10 mL于50 mL移液管中，再緩慢加入50 μL的濃鹽酸。渦旋混勻后，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。分別精密量取離心后的上清液1 mL和流動(dòng)相1 mL，置于10 mL離心管中，充分振蕩均勻后，溶液經(jīng)0.45 μm微孔膜過(guò)濾。

1.3.2 定量方法

分別精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的γ-聚谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備液至10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL溶液，溶液經(jīng)0.45 μm微孔膜過(guò)濾，得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與樣品溶液按1.2色譜條件測(cè)定，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰面積和質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合。將測(cè)得的樣品溶液中γ-聚谷氨酸鈉色譜峰面積帶入擬合方程，得聚谷氨酸樣品溶液濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品中γ-聚谷氨酸鈉含量。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法選擇

卡波姆具有很高的黏稠度，致使樣品無(wú)法直接通過(guò)0.45 μm的微孔膜進(jìn)行過(guò)濾，在對(duì)卡波姆溶解性充分了解的情況下，調(diào)節(jié)樣品的pH值，降低卡波姆在樣品中的溶解性，并以離心的方式進(jìn)行除去。通過(guò)在樣品中加入濃鹽酸的方式對(duì)pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)后的樣品溶液經(jīng)高速離心（12 000 r/min，15 min），取上清液用孔徑為0.45 μm的微孔膜進(jìn)行過(guò)濾，得到樣品的測(cè)試溶液。不同量的鹽酸對(duì)溶液調(diào)節(jié)的結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，在10 mL料液中隨著鹽酸加入量的增多，樣品逐漸產(chǎn)生渾濁，且黏度逐漸降低，當(dāng)鹽酸的加入量在低于50 μL時(shí)，雖然有部分卡波姆可以通過(guò)離心的方式去除，但是去除不完全，料液仍然無(wú)法進(jìn)行過(guò)濾；直到在料液中加入50 μL鹽酸時(shí)，離心后的上清液可以經(jīng)過(guò)0.45 μm的微孔膜濾過(guò)。由于隨著濃鹽酸體積的逐漸增加，料液的pH值會(huì)不斷降低，樣品在酸性越強(qiáng)的環(huán)境中越容易降解，影響檢測(cè)，因此選擇在10 mL料液中加50 μL濃鹽酸鹽的方式，對(duì)樣品進(jìn)行處理，并通過(guò)離心的方式將樣品中的卡波姆進(jìn)行有效分離。此外，通過(guò)在1.0 mg/mL的γ-聚谷氨酸鈉水溶液中加入50 μL濃鹽酸鹽的方式進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，證明γ-聚谷氨酸鈉在此環(huán)境下不會(huì)析出。由于加入的濃鹽酸的體積相對(duì)于樣品來(lái)說(shuō)很小，因此忽略濃鹽酸對(duì)料液中γ-聚谷氨酸鈉濃度的影響。

表1   樣品中加入不同體積濃鹽酸的處理效果T

ab. 1   The effect of adding different volumes of concentrated hydrochloric acid to the sample

 

2.2 流動(dòng)相選擇

在QBT 5189—2017《γ-聚谷氨酸》中規(guī)定液相色譜條件下，測(cè)定樣品中的γ-聚谷氨酸鈉時(shí)，流動(dòng)相（0.3 mol/L硫酸鈉溶液，pH=4.0）并不適合該產(chǎn)品的檢測(cè)。一方面，0.3 mol/L硫酸鈉溶液，鹽濃度較高，長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)對(duì)柱子及液相系統(tǒng)有一定的損害，縮短液相耗材的使用壽命。另一方面，由于產(chǎn)品的特殊性，使用此流動(dòng)相檢測(cè)時(shí)，噪聲會(huì)驟然增大，并且無(wú)樣品峰顯示。分別對(duì)硫酸鈉體系（0.3 mol/L硫酸鈉溶液）、磷酸鹽體系（0.1 mol/L PB溶液）、和氯化鈉體系（0.1 mol/L氯化鈉溶液）3種流動(dòng)相進(jìn)行了篩選試驗(yàn)，研究結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，使用標(biāo)準(zhǔn)中的流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定時(shí)，樣品不能正常出峰；在使用磷酸鹽體系的流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)樣時(shí)，在酸性條件下樣品不能正常出峰，而在中性條件下可以正常出峰；在使用氯化鈉體系的流動(dòng)相進(jìn)樣時(shí)，酸性條件和中性條件下樣品均能正常出峰，且酸性條件下峰的分離效果更好，因此選擇pH為4.0的氯化鈉作為樣品測(cè)定的流動(dòng)相。

表2   不同流動(dòng)相下樣品的出峰情況

Tab. 2   The situation of each peak in the sample under different mobile phases

 

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性

分別移取樣品空白輔料、對(duì)照品和樣品分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，如圖1所示。

圖1   系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖

Fig. 1   Chromatogram of System suitability test

由圖1可以看出，空白輔料中的其他成分在γ-聚谷氨酸鈉出峰的位置并未造成干擾，因此γ-聚谷氨酸鈉在樣品中的圖譜形態(tài)不會(huì)受到輔料成分的干擾。

2.4 線性方程、檢出限和定量限

取γ-聚谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，按照1.3.2方法制備系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后注入液相色譜儀，按照1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以γ-聚谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得線性回歸方程為y=28 392.7x+311.2，相關(guān)系數(shù)為0.999 6，表明γ-聚谷氨酸鈉質(zhì)量濃度在0.18～0.90 mg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系。

精密量取γ-聚谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相逐步稀釋后測(cè)定，以信噪比為3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限，以信噪比為10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限，測(cè)得的檢出限為18 μg/mL，定量限為45 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

移取適量聚谷氨酸鈉創(chuàng)面修復(fù)敷料（批號(hào)為20240523）樣品6份，按照1.3.1方法平行制備6份樣品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中γ-聚谷氨酸鈉含量及測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，γ-聚谷氨酸鈉測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.64%，說(shuō)明該方法的精密度良好，滿足檢測(cè)要求。

表3   精密度試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 3   Results of precision test

 

2.6 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別精密移取0.4、0.5、0.6 mL的γ-聚谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，精密加入空白輔料溶液5 mL，充分搖勻后，分別作為樣品濃度的80%、100%、120%回收率溶液，每個(gè)濃度平行制備3份，于回收率溶液中分別加水定容，搖勻后作為各回收率測(cè)試溶液，共9份。依法測(cè)定每份樣品中的γ-聚谷氨酸鈉濃度，并計(jì)算回收率，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，樣品加標(biāo)回收率為96.43%~98.71%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表4   樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 4   Results of recovery test

 

2.7 溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

移取適量聚谷氨酸鈉創(chuàng)面修復(fù)敷料（批號(hào)為20240523），按照1.3.1方法制備樣品溶液，測(cè)定在24 h之內(nèi)樣品溶液的色譜峰面積變化情況。制備好的樣品溶液分別于第0、1、2、6、8、24 h進(jìn)樣測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5   穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 5   Results of stability test

 

由表5可知，樣品溶液在24 h之內(nèi)，色譜峰面積變化較小，變化率小于2%，樣品溶液穩(wěn)定性良好。

 

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜測(cè)定聚谷氨酸鈉創(chuàng)面修復(fù)敷料中γ-聚谷氨酸鈉含量的方法。通過(guò)對(duì)卡波姆性質(zhì)的研究，實(shí)現(xiàn)了樣品中卡波姆的分離，排除了樣品中卡波姆對(duì)測(cè)定的干擾，為相關(guān)產(chǎn)品中卡波姆的分離提供了可靠的參考。

對(duì)不同流動(dòng)相的考察，挑選出了合適的流動(dòng)相，使色譜圖中的透明質(zhì)酸鈉和γ-聚谷氨酸鈉得到了有效分離，為高效液相色譜法測(cè)定γ-聚谷氨酸鈉含量時(shí)，相關(guān)產(chǎn)品中含有干擾成分時(shí)提供了解決問(wèn)題的方向，同時(shí)為高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)成分較復(fù)雜產(chǎn)品中γ-聚谷氨酸鈉含量的測(cè)定提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。通過(guò)全面驗(yàn)證，證明該方法具有良好的線性，精密度好，準(zhǔn)確度高，可用于γ-聚谷氨酸鈉相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

 

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