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將安全藥理學(xué)終點(diǎn)納入重復(fù)給藥毒理研究中符合動(dòng)物“3R”原則，也節(jié)約研究成本。那么這種合并研究需要注意哪些細(xì)節(jié)呢？圍繞這個(gè)話題略作討論。

 

重復(fù)給藥毒理研究中納入安全藥理學(xué)終點(diǎn)可以從科學(xué)和法規(guī)兩個(gè)層面分析。

 

首先是科學(xué)層面。早在20世紀(jì)70年代末，由Gerhard Zbinden領(lǐng)導(dǎo)的毒理學(xué)先驅(qū)們就開始呼吁在毒性研究中納入安全藥理學(xué)終點(diǎn)，隨后這一觀點(diǎn)得到了業(yè)內(nèi)同行的呼應(yīng)。將安全藥理學(xué)終點(diǎn)納入重復(fù)給藥毒性研究的科學(xué)依據(jù)主要基于以下幾點(diǎn)：

 

1）延遲效應(yīng)現(xiàn)象：?jiǎn)为?dú)的安全藥理學(xué)研究通常為單次給藥。如果僅評(píng)估單次給藥的效應(yīng)，可能會(huì)遺漏延遲出現(xiàn)的效應(yīng)。例如胺碘酮對(duì)QT間期的延遲性、進(jìn)行性影響，通常在心肌中積累數(shù)天甚至數(shù)周后才顯現(xiàn)。又如用于治療冠心病、糖尿病、肥胖癥、關(guān)節(jié)炎、注意力缺陷多動(dòng)障礙和精神障礙的藥物可能會(huì)增加心血管不良事件的發(fā)生率或心血管風(fēng)險(xiǎn)因素。這些風(fēng)險(xiǎn)通常是在長(zhǎng)期治療后才顯現(xiàn)的。

 

2）功能變化與病理變化的關(guān)系：一些功能變化可能先于病理?yè)p傷出現(xiàn)，或者在較低暴露水平下發(fā)生，因此可以作為臨床可轉(zhuǎn)化的生物標(biāo)志物，用于指導(dǎo)和限制臨床試驗(yàn)中的劑量遞增。另外，一些病理變化是功能變化的結(jié)果，如由于藥物誘導(dǎo)的持續(xù)心動(dòng)過速和/或低血壓，導(dǎo)致犬和猴出現(xiàn)特定的心臟病變。合并研究可以在同一個(gè)體系中考察功能變化和病理變化的關(guān)系。

 

再看下法規(guī)層面。

 

1）1997年ICH S6關(guān)于生物制品的臨床前安全性評(píng)價(jià)指南頒布，指出安全藥理學(xué)試驗(yàn)用于檢測(cè)潛在毒性的功能性指標(biāo)，這些功能性指標(biāo)可以通過單獨(dú)的試驗(yàn)也可以結(jié)合在毒性試驗(yàn)中考察。

 

2）FDA關(guān)于探索性新藥IND研究的指南也鼓勵(lì)將安全藥理學(xué)終點(diǎn)納入毒性研究（Guidance for Industry, Investigators, and Reviewers Exploratory IND Studies,2006），從而減少了單獨(dú)開展安全性藥理學(xué)研究的必要性。

 

3）2009年修訂后的ICH指導(dǎo)文件（S9）關(guān)于腫瘤藥物非臨床評(píng)價(jià)的指南也基本取消了對(duì)單獨(dú)安全性藥理學(xué)研究的法規(guī)要求，心血管、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)這些參數(shù)可納入到一般毒理學(xué)試驗(yàn)中。在非嚙齒類動(dòng)物中進(jìn)行了給藥后的詳細(xì)臨床癥狀觀察及合適的心電圖檢查，通常認(rèn)為已經(jīng)足夠。

 

4）此外，某些專門的法規(guī)要求還包括納入特定的行為測(cè)量，如ICH S5(R2): detection of toxicity to reproduction for medicinal products and toxicity to male fertility和Guideline on the need for non-clinical testing in juvenile animals of pharmaceuticals for paediatric indication(EMA, 2008)。這些出生后發(fā)育的法規(guī)指南要求對(duì)在妊娠期間暴露于受試物的F1代進(jìn)行行為測(cè)試，以及幼齡動(dòng)物毒理研究中，對(duì)新生和/或幼年動(dòng)物進(jìn)行給藥，需使用行為測(cè)試進(jìn)行評(píng)估。行為測(cè)試包括功能性觀察組合（FOB）、運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)（例如旋轉(zhuǎn)桿）和學(xué)習(xí)與記憶測(cè)試。因此，如果以上行為學(xué)評(píng)估可以納入這些專門的研究中，那么原則上也可以將其納入一般毒理研究中。

 

安全藥理終點(diǎn)納入一般毒理研究面臨的挑戰(zhàn)

 

雖然無論科學(xué)層面還是法規(guī)層面，都有將安全藥理學(xué)終點(diǎn)納入一般毒理研究的支持性證據(jù)。但這一合并研究也存在一些客觀挑戰(zhàn)。

 

重復(fù)給藥毒性研究的目的是讓動(dòng)物在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)暴露于不同劑量的受試物，評(píng)估全身毒性指標(biāo)，并最終在尸檢后評(píng)估組織病理學(xué)變化。任何額外的安全藥理學(xué)測(cè)量都不應(yīng)且不能干擾這些目標(biāo)。然而，研究設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和環(huán)境可能并不適合獲取高質(zhì)量的安全藥理學(xué)數(shù)據(jù)。下圖中，圖1a是為安全藥理學(xué)研究專門設(shè)計(jì)的嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，圖1b則是典型的嚙齒動(dòng)物毒理研究飼養(yǎng)室（及準(zhǔn)備室），黃色區(qū)域是進(jìn)行功能測(cè)試的場(chǎng)所，比較直觀展現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)差異可能引入的挑戰(zhàn)。

 

 

將安全藥理學(xué)評(píng)估整合到一般毒理研究中需要一定的妥協(xié)和調(diào)整。例如，根據(jù)研究類型和功能測(cè)量的需求，可能需要錯(cuò)開開始日期，例如連續(xù)兩天分散進(jìn)行，以便對(duì)主研究組的所有動(dòng)物進(jìn)行測(cè)量，或者在安全藥理學(xué)評(píng)估當(dāng)天錯(cuò)開給藥時(shí)間，以便在藥物濃度達(dá)到最大值（Tmax）的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。

 

還有一個(gè)挑戰(zhàn)來自重復(fù)給藥的藥物耐受性。重復(fù)給藥毒性研究的第一天通常是工作人員最繁忙的一天；當(dāng)天已經(jīng)安排了在特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行TK采樣，而且操作室相對(duì)擁擠，有參與毒性研究的技術(shù)人員、課題負(fù)責(zé)人、質(zhì)量保證人員甚至委托方人員。其實(shí)并不是一個(gè)適合安靜且仔細(xì)測(cè)量生理和行為參數(shù)的時(shí)間點(diǎn)。但如果選擇在第2天進(jìn)行測(cè)量，可能會(huì)錯(cuò)過首次給藥的峰值效應(yīng)，而這一效應(yīng)可能在第二次給藥時(shí)已經(jīng)減弱或完全改變。但如果第1天受試物出現(xiàn)一定程度的不良反應(yīng)，就不得不在第2天進(jìn)行安全藥理數(shù)據(jù)收集，算是一種權(quán)衡。所以，一般安全性比較好的候選藥物，比如某些單抗或者多肽，比較適合安全藥理伴隨一般毒理開展。這里要注意下，如果不單獨(dú)開展安全藥理研究，而是將其并入重復(fù)給藥毒理，屬于后者替代前者。對(duì)于這種情況，藥物耐受性的挑戰(zhàn)是要重視的，需最大可能保障安全藥理數(shù)據(jù)的高質(zhì)量獲取。但如果單獨(dú)開展安全藥理研究，同時(shí)重復(fù)給藥加設(shè)安全藥理終點(diǎn)，屬于后者是前者的補(bǔ)充，要求就靈活很多，不太需要對(duì)毒理設(shè)計(jì)進(jìn)行太多調(diào)整。

 

除了以上，安全藥理學(xué)研究和一般毒理研究在細(xì)節(jié)方面還有很多區(qū)別，如下表所示。

 

 

合適的安全藥理評(píng)價(jià)方法

 

在重復(fù)給藥毒性研究中用于評(píng)估安全藥理學(xué)終點(diǎn)，除了來自研究設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和環(huán)境的挑戰(zhàn)，安全藥理參數(shù)收集的方法也很關(guān)鍵，理想情況下應(yīng)是非侵入性的、不會(huì)引起應(yīng)激、不需要麻醉且不需要限制進(jìn)食。否則，應(yīng)考慮設(shè)置衛(wèi)星組，甚至單獨(dú)開展研究。設(shè)備需要便于攜帶且相對(duì)小巧：理想情況下，應(yīng)將設(shè)備移動(dòng)到動(dòng)物飼養(yǎng)處，而不是將動(dòng)物轉(zhuǎn)移到設(shè)備處?；蛘撸O(shè)備可以是設(shè)施的一部分，并專門用于測(cè)量（如非侵入性遙測(cè)接收器）。測(cè)量應(yīng)由熟悉如何獲取高質(zhì)量安全藥理學(xué)數(shù)據(jù)的科學(xué)家和技術(shù)人員進(jìn)行，并且他們應(yīng)具備收集、分析和解釋數(shù)據(jù)的能力。下表列出了適用于重復(fù)給藥毒性研究主試驗(yàn)動(dòng)物的安全藥理相關(guān)指標(biāo)收集方法示例，主要包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)。

 

 

特定器官功能的應(yīng)用

 

安全性藥理學(xué)評(píng)估的五個(gè)器官功能包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)。除此之外，有時(shí)還會(huì)增加全身代謝功能的評(píng)估。

 

心血管系統(tǒng)

 

ECG間期和形態(tài)

 

近年來，市場(chǎng)上出現(xiàn)了適用于犬和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的馬夾式的非侵入式、便攜式遙測(cè)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)能夠在動(dòng)物的自然環(huán)境中，對(duì)清醒或睡眠狀態(tài)下的自由活動(dòng)動(dòng)物進(jìn)行至少24小時(shí)的連續(xù)II導(dǎo)聯(lián)心電圖記錄。這種遙測(cè)系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量?jī)?yōu)于傳統(tǒng)“快照式”記錄方法獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量，包括實(shí)現(xiàn)更低的靜息心率，并且數(shù)據(jù)量更多。這種方法能夠確定效應(yīng)的起始時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、強(qiáng)度和可逆性，以及劑量依賴性和PK-PD關(guān)系。將QT間期與RR間期作圖可以避免QT校正因子帶來的不準(zhǔn)確問題，并能揭示藥物在不同心率水平下的誘導(dǎo)變化。

 

與檢測(cè)QT間期效應(yīng)不同，在自然發(fā)生的心率升高期間進(jìn)行采樣有助于檢測(cè)鈉通道阻斷劑引起的QRS間期延長(zhǎng)。與hERG鉀通道阻斷不同，鈉通道阻斷是心率依賴的。與快照式心電圖相比，24小時(shí)采樣期間檢測(cè)到心律失常的可能性更大，同時(shí)也能檢測(cè)到研究前已存在的波形異常。另外，與植入式遙測(cè)設(shè)備的單次給藥安全藥理學(xué)研究相結(jié)合時(shí)，非侵入式心電圖測(cè)量有時(shí)可以揭示在重復(fù)給藥時(shí)加劇的效應(yīng)。

 

左心室功能

 

在未麻醉的犬中使用超聲心動(dòng)圖是一種成熟的技術(shù)?？梢酝ㄟ^超聲心動(dòng)圖在未經(jīng)鎮(zhèn)靜、預(yù)先訓(xùn)練、綁定（或側(cè)臥位）的犬以及小型豬中監(jiān)測(cè)左心室功能。超聲心動(dòng)圖也可以用于食蟹猴，但需要鎮(zhèn)靜或麻醉。在比格犬中，通過超聲心動(dòng)圖得出的左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）與通過植入式遙測(cè)設(shè)備在同一批動(dòng)物中測(cè)量的左心室最大壓力變化率（dP/dtmax）之間觀察到良好的一致性。此外，QA間期（心電圖的Q波與主動(dòng)脈壓力波上升的時(shí)間間隔）也可以用作心室收縮力的指標(biāo)。

 

動(dòng)脈血壓

 

在嚙齒類動(dòng)物中，非侵入性血壓測(cè)量方法采用尾袖法。然而，這種方法只能可靠測(cè)量收縮壓和心率，并且需要預(yù)熱和約束才能獲得測(cè)量值。即使在研究前適應(yīng)了這些記錄條件，所獲得的收縮壓和心率值仍高于未約束且植入遙測(cè)設(shè)備的動(dòng)物。鑒于法規(guī)要求重復(fù)給藥毒性研究在兩種動(dòng)物中進(jìn)行，在較大的非嚙齒動(dòng)物中進(jìn)行心血管評(píng)估更為合理。尾袖血壓測(cè)量法本身在犬中也有很好的應(yīng)用，而最近引入的高分辨率振蕩法（HDO）能夠捕捉血壓波形，并準(zhǔn)確測(cè)量收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓。HDO也已用于食蟹猴。

 

對(duì)于犬，有可供使用的便攜式尾袖法，結(jié)合非侵入性遙測(cè)技術(shù)在同一動(dòng)物中同時(shí)測(cè)量心電圖和血壓。另一種方法是通過連接到微型遙測(cè)發(fā)射器的動(dòng)脈導(dǎo)管，在犬或食蟹猴中進(jìn)行最小侵入性血壓測(cè)量。

 

神經(jīng)系統(tǒng)

 

全面神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估

 

由于神經(jīng)系統(tǒng)功能的極端多樣性和復(fù)雜性，無法設(shè)計(jì)出一種方便的體內(nèi)評(píng)估方法來涵蓋所有功能。因此，在安全性藥理學(xué)中，首先使用的是神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估，形式可以是功能性觀察組合（FOB）或Irwin試驗(yàn)。

 

自動(dòng)化活動(dòng)分析

 

嚙齒類動(dòng)物的活動(dòng)可以通過兩種方式評(píng)估：籠內(nèi)活動(dòng)或在新環(huán)境中活動(dòng)（自發(fā)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)）。這兩種測(cè)量方法有很大不同。后者涉及探索動(dòng)機(jī)與在不熟悉環(huán)境中焦慮增加之間的沖突?？梢允褂霉鈻抨嚵谢蛞曨l跟蹤來監(jiān)測(cè)。在新環(huán)境中，動(dòng)物的活動(dòng)和直立行為最初很高，隨著動(dòng)物探索和適應(yīng)環(huán)境，大約30分鐘后逐漸減弱，最終大部分時(shí)間處于靜止或梳理毛發(fā)狀態(tài)?；\內(nèi)活動(dòng)則沒有沖突或適應(yīng)性成分。

 

目前，正在出現(xiàn)一種新技術(shù)，用于在群居飼養(yǎng)的嚙齒動(dòng)物的籠內(nèi)測(cè)量個(gè)體的活動(dòng)、行為和體溫，而無需外科植入遙測(cè)發(fā)射器?？梢允褂弥踩肫は碌纳漕l識(shí)別微芯片應(yīng)答器（“RFID芯片”）通過放置在籠子下方的基板閱讀器檢測(cè)，來測(cè)量群居飼養(yǎng)嚙齒動(dòng)物的籠內(nèi)活動(dòng)；這種方法還可以結(jié)合測(cè)量活動(dòng)和體溫。同樣，也可以通過這種方式監(jiān)測(cè)群居飼養(yǎng)嚙齒動(dòng)物的個(gè)體食物和水分?jǐn)z入量。

 

犬和猴的活動(dòng)可以通過在它們項(xiàng)圈中的加速度計(jì)或作為非侵入性遙測(cè)系統(tǒng)的一部分來測(cè)量。使用不同顏色的外套可以實(shí)現(xiàn)對(duì)群居飼養(yǎng)的食蟹猴進(jìn)行定量視頻跟蹤。

 

其它神經(jīng)行為系統(tǒng)指標(biāo)還包括視覺功能、瞳孔、唾液分泌、肌肉功能等，在上表中已作介紹。

 

呼吸系統(tǒng)

 

可以從嚙齒動(dòng)物（通常是大鼠）中輕松獲取呼吸參數(shù)，使用全身描記術(shù)是一種非侵入性、無需約束的方法，通過測(cè)量因吸氣和呼氣導(dǎo)致的腔室壓力變化來實(shí)現(xiàn)。使用全身描記術(shù)的獨(dú)立安全藥理學(xué)研究通常在給藥前需要60-90分鐘的穩(wěn)定期，以確保穩(wěn)定的呼吸信號(hào)，并減少因活動(dòng)、嗅探、梳理毛發(fā)或直立行為導(dǎo)致的信號(hào)干擾。給藥后記錄通常持續(xù)長(zhǎng)達(dá)6小時(shí)。該技術(shù)必須采用適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸妊a(bǔ)償，以確保準(zhǔn)確測(cè)定潮氣量。將這種技術(shù)應(yīng)用于重復(fù)給藥毒理研究是可行的。

 

可以使用非約束、帶馬夾的遙測(cè)方法在犬中測(cè)量呼吸參數(shù)。這種技術(shù)稱為呼吸感應(yīng)描記術(shù)，涉及在胸腔和腹部放置柔性帶，能夠連續(xù)測(cè)量長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的呼吸參數(shù)。這種非侵入性遙測(cè)技術(shù)還可以同時(shí)測(cè)量心血管參數(shù)，并且同樣可以用于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。

 

其它如胃腸道系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、代謝功能等，用的較少，后續(xù)有機(jī)會(huì)再分享吧。

 

案例分享一（144款、單抗、多抗、ADC）

 

筆者回顧性分析了已上市的144款單抗、多抗及ADC類藥物，一起看下這些產(chǎn)品在實(shí)際申報(bào)過程中，安全藥理學(xué)研究是單獨(dú)開展還是伴隨一般毒理開展，還是單獨(dú)+伴隨組合的形式。

 

144款藥物中，單抗、雙抗、ADC的數(shù)量分別是118、16和10款。

 

118款單抗中，78款藥物的安全藥理學(xué)研究伴隨一般毒理研究開展，12款單獨(dú)開展，5款藥物是單獨(dú)+伴隨一般毒理相組合的形式，即部分試驗(yàn)單獨(dú)開展如神經(jīng)系統(tǒng)安全藥理，部分安全藥理終點(diǎn)則伴隨在一般毒理研究中。這其中，還有21款藥物未開展安全藥理學(xué)研究。未開展安全藥理研究的多是生物類似藥，占15款。其它不開展安全藥理學(xué)研究的原因主要是沒有合適的相關(guān)動(dòng)物種屬，如Daratumumab、Elotuzumab、Spesolimab。

 

16款雙抗中，13款安全藥理學(xué)研究伴隨一般毒理研究進(jìn)行，2款選擇了單獨(dú)開展，1款未開展。未開展安全藥理學(xué)研究的這款雙抗是Tebentafusp，這款蛋白不與動(dòng)物靶點(diǎn)結(jié)合，所以非臨床毒理研究?jī)H開展的體外評(píng)價(jià)（Tebentafusp can only recognize human HLA; therefore, all nonclinical toxicology studies were conducted in vitro. Therefore, no specific safety pharmacology studies were conducted）。

10款A(yù)DC藥物，6款選擇伴隨重復(fù)給藥毒理研究開展，4款單獨(dú)開展了安全藥理學(xué)研究。當(dāng)然，hERG試驗(yàn)屬于體外研究，不計(jì)入內(nèi)。

 

所以，很明顯，大部分生物藥物安全藥理學(xué)研究是以伴隨一般毒理研究開展的形式為主，而且是心血管、呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的終點(diǎn)均納入一般毒理試驗(yàn)中考察。

 

 

案例分享二（37款化藥）

 

以2023年FDA批準(zhǔn)上市的37款新分子實(shí)體藥物作為案例，分析下化藥安全藥理研究通常單獨(dú)開展還是伴隨一般毒理研究試驗(yàn)開展。如下表所示，羅列了產(chǎn)品的商品名、通用名、獲批上市時(shí)間、開展形式和研究?jī)?nèi)容示例。

 

37款化藥中，25款選擇了單獨(dú)開展的形式。6款采用的單獨(dú)開展和伴隨開展相結(jié)合的形式，其中2款選擇大鼠CNS和呼吸伴隨大鼠重復(fù)給藥毒理開展，2款僅大鼠呼系統(tǒng)安全藥理伴隨一般毒理開展。

 

3款則選擇全部安全藥理研究終點(diǎn)伴隨一般毒理試驗(yàn)開展。QALSODY采用所有安全藥理研究終點(diǎn)伴隨一般毒理試驗(yàn)開展，可能原因與本品為鞘內(nèi)注射，治療SOD1 基因突變的漸凍癥這一罕見病有關(guān)。MIEBO則僅在大鼠MTD中伴隨了CNS研究，未開展其它安全藥理學(xué)研究，可能與本品為滴眼液，系統(tǒng)暴露有限，或可能其它劑型考察過安全藥理終點(diǎn)，感興趣的可以進(jìn)一步求證。AUGTYRO心血管安全藥理研究伴隨食蟹猴一般毒理，可能與本品為抗腫瘤藥，適用ICH S9有關(guān)。

 

POSLUMA未開展安全藥理學(xué)研究，因本品為微劑量放射性物質(zhì)。

 

總而言之，大部分化藥還是以安全藥理研究單獨(dú)開展的形式進(jìn)行。再不濟(jì)也是以單獨(dú)開展為主，伴隨開展為輔，把相對(duì)沒那么重要的呼吸系統(tǒng)安全藥理研究摘出去，放到一般毒理試驗(yàn)中。