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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-10-20 21:45
摘 要： 建立高效液相色譜同時(shí)測定化妝品中5種甲醛緩釋體類防腐劑含量的方法。樣品經(jīng)甲醇- 0.1%磷酸水溶液（體積比為8∶2）溶解超聲提取后，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，通過C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離，分別于210、310 nm波長下，采用二極管陣列檢測器進(jìn)行定量分析。5種甲醛緩釋體類防腐劑的質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為4～20 mg/kg，定量限為10～60 mg/kg。加標(biāo)樣品的平均回收率為90.7%～107.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～2.1%（n=6）。該方法可同時(shí)測定化妝品中5種甲醛緩釋體類物質(zhì)的含量。
關(guān)鍵詞： 化妝品； 甲醛緩釋體類防腐劑； 高效液相色譜
作為化妝品中的關(guān)鍵添加劑，防腐劑主要通過抑制微生物的生長繁殖，防止產(chǎn)品腐敗變質(zhì)、避免微生物污染，其應(yīng)用范圍涵蓋護(hù)膚、護(hù)發(fā)、彩妝、香水、染發(fā)及燙發(fā)等各類產(chǎn)品[1?3]。其中，甲醛緩釋體類防腐劑作為重要的一類，屬于甲醛聚合物，能在特定條件下通過精準(zhǔn)控制甲醛釋放速率，實(shí)現(xiàn)對微生物生長的有效抑制，是化妝品防腐的重要策略[4?5]。然而，由于防腐劑兼具抑菌活性與生物毒性，已成為化妝品中的潛在風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)。過量使用不僅可能刺激皮膚，還可能引發(fā)粘膜慢性中毒、過敏性皮炎、光敏反應(yīng)等不良反應(yīng)[6?7]，甚至增加癌變風(fēng)險(xiǎn)[8?9]。在眾多防腐劑中，甲醛釋放體類防腐劑因?qū)θ祟惤】荡嬖跐撛谖：?，近年來逐漸受到廣泛關(guān)注。
近年來，甲醛釋放體類防腐劑因安全性相對良好，在化妝品中的使用頻率逐步攀升。不過，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）已對這類防腐劑作出明確限定，例如2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、羥甲基甘氨酸鈉、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、咪唑烷基脲在化妝品中的最大允許使用濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為0.1%、0.6%、0.5%、0.6%、0.1%[10]。目前化妝品中防腐劑的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[11?13]、氣相色譜（GC）法[14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法[15]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法[16]。其中，高效液相色譜法快捷方便、通用性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、結(jié)果重現(xiàn)性高，因而得到廣泛應(yīng)用?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）雖涵蓋了一般防腐劑的檢測方法，但對于甲醛釋放體類防腐劑，目前仍缺乏針對性的具體檢測標(biāo)準(zhǔn)與方法。歐盟SCCNFP/586/02號報(bào)告也指出，對于1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、咪唑烷基脲等物質(zhì)，目前缺乏法定的檢測方法[17]。筆者建立一種能夠同時(shí)測定化妝品中2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、羥甲基甘氨酸鈉、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、咪唑烷基脲5種甲醛緩釋體類防腐劑的HPLC法，為化妝品企業(yè)和檢測機(jī)構(gòu)提供參考。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，配備DAD檢測器，美國賽默飛世爾科技有限公司。
分析天平：BSA224S型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。
超聲波清洗機(jī)：YT-500DE型，中國上海葉拓科技有限公司。
高速離心機(jī)：TGL-16M型，中國濟(jì)南鑫馳醫(yī)療科技有限公司。
渦旋儀：MS3型，德國艾卡公司。
純水制備機(jī)：GWB-1型，中國北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。
5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷對照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.1%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。
6-1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、咪唑烷基脲、羥甲基甘氨酸鈉、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇對照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均大于98%，上海畢合生物化學(xué)技術(shù)有限公司。
磷酸：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
甲醇、乙腈：均為色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
化妝品樣品：膏霜、乳液及水劑類均購自國內(nèi)某化妝品品牌。
實(shí)驗(yàn)用水為GWB-1型純水機(jī)制備的一級水。
1.2 儀器工作條件
色譜柱：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技貿(mào)易有限公司)；柱溫：40 ℃；流動相：A相為甲醇，B相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸溶液，C相為乙腈,流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1；進(jìn)樣體積：10 µL；檢測波長：210 nm (咪唑烷基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷)和310 nm (羥甲基甘氨酸鈉)。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution program
1.3 實(shí)驗(yàn)步驟
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密稱取2-溴-2-硝基丙烷-1,3二醇20 mg、1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲各20 mg、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷30 mg，分別置于10.00 mL棕色容量瓶中，加入甲醇超聲溶解并定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度分別為2.0、2.0、3.0 g/L的3種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)儲備液；精密稱取咪唑烷基脲20 mg、羥甲基甘氨酸鈉5 mg，分別置于10.00 mL棕色容量瓶中，加入20%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液超聲溶解并定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度分別為2.0、0.5 g/L的2種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。
系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取5種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.010、0.020、0.040、0.100、0.200、0.400 mL于6只10.00 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，制得羥甲基甘氨酸鈉的質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20 mg/L，咪唑烷基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲質(zhì)量濃度均分別為2、4、8、20、40、80 mg/L，5-溴-5-硝基- 1,3-二噁烷的質(zhì)量濃度分別為3、6、12、30、60、120 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.3.2 樣品溶液的制備
樣品溶液：準(zhǔn)確稱取0.5 g化妝品樣品，置于10 mL具塞比色管中，加入約9 mL甲醇-0.1%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸溶液（體積比為8∶2）渦旋震蕩，混勻，然后放入超聲波清洗機(jī)中超聲提取25 min，冷卻至室溫后，再使用甲醇-0.1%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸溶液（體積比為8∶2）定容至標(biāo)線，渦旋搖勻，取適量提取液于離心管中，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 µm有機(jī)系濾膜過濾，濾液作為樣品溶液。同法制備空白對照溶液。
混合加標(biāo)樣品溶液：準(zhǔn)確稱取0.5 g化妝品樣品，置于10 mL具塞比色管中，分別加入0.100 mL咪唑烷基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷4種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和0.400 mL羥甲基甘氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再按照上述樣品處理步驟制得混合加標(biāo)樣品溶液。
1.3.3 定量方法
取適量樣品溶液，在1.2儀器工作條件下，以色譜峰面積進(jìn)行定量，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算5種甲醛緩釋體類防腐劑的含量。
2 結(jié)果與討論
2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
2.1.1 提取溶劑的選擇
5種甲醛緩釋體類防腐劑在不同溶劑中溶解度不同，2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲和5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷易溶于甲醇，咪唑烷基脲和羥甲基甘氨酸鈉不能完全溶于甲醇，而溶于以甲醇為溶劑的溶液?？紤]到溶劑效應(yīng)，不同酸堿度對于色譜峰峰形有一定影響，故而分別設(shè)計(jì)了0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液（體積比為3∶7）、甲醇、甲醇-0.1%磷酸溶液（體積比為8∶2） 4種提取溶劑。試驗(yàn)結(jié)果表明，以上4種提取溶劑的提取效率分別為55%、83%、91%、98%，表明使用少量的磷酸溶液會使色譜峰峰形更加對稱，峰寬更窄，從而降低雜峰對目標(biāo)峰的干擾概率，因此最終選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液（體積比為8∶2）作為提取溶劑。
2.1.2 色譜柱的選擇
分別選擇CN柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、C16柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種色譜柱進(jìn)行比較。結(jié)果表明，CN柱和C16柱對5種目標(biāo)化合物保留情況均不理想，色譜峰形較差，而且C16柱疏水性比C18柱弱，色譜峰出峰時(shí)間過早，極易受到雜質(zhì)峰的干擾，無法準(zhǔn)確定量；而C18柱對5種目標(biāo)物的分離效果良好，5種目標(biāo)物保留時(shí)間適中，不會受到溶劑峰和雜質(zhì)峰的干擾，能夠準(zhǔn)確定性和定量，因此選擇C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）作為分析柱。
2.1.3 流量的選擇
比較了1.2、1.0、0.7 mL/min 3種不同流量對5種甲醛緩釋體類防腐劑分離效果和出峰時(shí)間的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流量為1.2 mL/min時(shí)，目標(biāo)峰色譜保留時(shí)間過早，1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、咪唑烷基脲和2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇三者之間的分離效果較差，而且容易受到溶劑峰和雜峰的干擾，造成定量結(jié)果不準(zhǔn)確；當(dāng)流量為0.7 mL/min時(shí)，5種甲醛緩釋體類防腐劑的分離度得到了改善，但是色譜峰形較差，峰寬較寬且分析時(shí)間較長。綜合考慮，最終選擇流動相流量為1.0 mL/min，不僅節(jié)約了時(shí)間，還達(dá)到了預(yù)期的分離效果。
2.1.4 流動相的選擇
流動相的不同影響色譜柱的使用壽命、色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度以及峰形和分離效果。采用體積分?jǐn)?shù)分別為0.02%、0.1%、2%磷酸溶液作為流動相，研究發(fā)現(xiàn)磷酸體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，其溶液pH值偏低，會降低色譜柱的使用壽命；當(dāng)磷酸體積分?jǐn)?shù)為0.02%時(shí)，目標(biāo)峰峰形和分離效果變差，而且相比較于采用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的磷酸溶液時(shí)響應(yīng)值變低，從而影響方法的最低檢出濃度，因此最終確定流動相中磷酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1%。
2.1.5 柱溫的選擇
當(dāng)其他實(shí)驗(yàn)條件相同時(shí)，分別設(shè)定25、30、40、50 ℃ 4種不同柱溫箱溫度，考察柱溫對出峰時(shí)間的影響。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫分別為25、30 ℃時(shí)，目標(biāo)峰的出峰時(shí)間相似；當(dāng)柱溫為50 ℃時(shí)，出峰時(shí)間提前，從而導(dǎo)致1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、咪唑烷基脲和2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇3種物質(zhì)的色譜峰受到溶劑峰干擾；當(dāng)柱溫設(shè)定為40 ℃時(shí)，上述3種甲醛緩釋體類防腐劑的出峰時(shí)間并不會提前，而5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷和羥甲基甘氨酸鈉的出峰時(shí)間會提前，從而節(jié)約了儀器的分析時(shí)間，使實(shí)驗(yàn)更加快速高效，因此柱溫設(shè)定為40 ℃。
2.1.6 檢測波長的確定
5種甲醛緩釋體類防腐劑分別在200、210、260、310、355 nm處有紫外吸收，因此利用高效液相色譜儀二極管陣列檢測器分別設(shè)置以上檢測波長對5種防腐劑進(jìn)行分析。結(jié)果表明，咪唑烷基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷4種防腐劑均在210 nm波長處響應(yīng)強(qiáng)度較高，羥甲基甘氨酸鈉在310 nm波長處響應(yīng)強(qiáng)度較高，且受基線干擾最小，因此最終確定咪唑烷基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、1,3-二羥甲基- 5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷檢測波長均為210 nm，羥甲基甘氨酸鈉檢測波長為310 nm。
2.2 專屬性試驗(yàn)
按照1.2儀器工作條件分別對空白對照溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合加標(biāo)樣品溶液進(jìn)行測定，色譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，在1.2儀器工作條件下，加標(biāo)樣品溶液中的5種甲醛緩釋體類防腐劑出峰時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中5種目標(biāo)物的出峰時(shí)間一致，各目標(biāo)峰的峰形對稱，分離效果良好，而且不受空白溶液中雜質(zhì)峰的干擾，說明該方法具有良好的專屬性。
圖1 空白溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、加標(biāo)樣品溶液色譜圖
Fig. 1 Chromatogram of blank control solution， mixed standard solution，mixed spiked sample solution
1—咪唑烷基脲；2—1，3-二羥甲基-5，5-二甲基乙內(nèi)酰脲；3—2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇；4—5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷；5—羥甲基甘氨酸鈉
2.3 線性關(guān)系、檢出限和定量限
選取1.3.1中系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行測定，以5種甲醛緩釋體類防腐劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并計(jì)算線性回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)，然后確定3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）對應(yīng)的質(zhì)量濃度，再根據(jù)稱樣質(zhì)量和定容體積，換算成樣品中的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/kg）表示，作為方法的檢出限和定量限。5種甲醛緩釋體類防腐劑的線性范圍（質(zhì)量濃度）、線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。由表2可知，5種甲醛緩釋體類防腐劑的質(zhì)量濃度在各自的范圍內(nèi)與其對應(yīng)的色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法的檢出限為4~20 mg/kg，方法的定量限為10~60 mg/kg，表明該方法具有較高的靈敏度。
表2 5種防腐劑的線性范圍（質(zhì)量濃度）、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
Tab. 2 Linear ranges（mass concentration）, linear equations, correlation coefficients, detected limits, and quantified limits of 5 preservatives
2.4 樣品加標(biāo)回收及精密度試驗(yàn)
取水劑、膏霜、乳液3種不同基質(zhì)空白樣品，分別進(jìn)行低、中、高3種質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，按照1.3.2處理方法，每個(gè)質(zhì)量濃度水平平行制備6份加標(biāo)樣品溶液，然后在1.2儀器工作條件下進(jìn)行測定，并計(jì)算加標(biāo)樣品的平均回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，在水劑、膏霜、乳液3種不同基質(zhì)樣品中，5種甲醛緩釋體類防腐劑的加標(biāo)平均回收率為90.7% ~ 107.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3% ~ 2.1%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度，滿足分析測試要求。
表3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）
Tab. 3 Results of sample spiking recovery test（n=6）
3 結(jié)語
建立了高效液相色譜同時(shí)測定化妝品中2-溴- 2-硝基丙烷-1,3-二醇、咪唑烷基脲、1,3-二羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、羥甲基甘氨酸鈉5種甲醛緩釋體類防腐劑含量的分析方法。該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡單、快速高效、準(zhǔn)確可靠，具有較好的精密度和較高的準(zhǔn)確度，可為化妝品中甲醛緩釋體類防腐劑的測定提供一定的參考價(jià)值。
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來源：化學(xué)分析計(jì)量
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