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為了確保藥品分析方法的穩(wěn)健性與方法轉移的重現性，中國藥典在高效液相色譜法中規(guī)定色譜參數可進行適當調整；隨著歷版藥典的更新，色譜參數允許調整范圍的規(guī)定逐步明確。2025年版中國藥典中規(guī)定，“品種正文項下規(guī)定的色譜條件（參數），除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等，均可適當調整”。這一規(guī)定體現藥典基于對色譜理論的深刻理解，為分析人員在實際工作中進行方法重現和轉移提供了清晰的依據。

新版藥典中對色譜柱參數的調整給出了具體的指導，規(guī)定了詳細的調整范圍，如改變填充劑粒徑（dp）和柱長（L）后L/dp的值應在原值的-25%~+50%范圍內、流速與進樣體積可使用色譜柱尺寸與填料粒徑相關的計算公式進行調整。這些調整范圍是如何設定的，又有哪些理論依據，本文以改變填充劑粒徑（dp）和柱長（L）參數為例，向大家做詳細剖析。

一、理論基礎

1.1 范第姆特方程（Van Deemter Equation）與Giddings方程

范第姆特方程是色譜理論中的基石，它定量地描述了影響色譜峰塔板高度的三個主要因素：渦流擴散（A）、縱向擴散（B/u）和傳質阻力（C·u）。

H = A + B/u + C·u

Giddings方程在Van Deemter方程的基礎上，結合液體與氣體在傳質過程中的差異進行修正，同時高效液相色譜柱中流動相線速度通常＞1ml/s，縱向擴散項（B/u）可忽略不計，固定液為單分子層官能團，固定相傳質阻力項（Cs·u）也可以忽略，因此公式簡化為：

H = A + Cm·u + Csm·u

A（渦流擴散項）與填料顆粒的大小直接相關，A = 2λdp，其中λ是與填充技術相關的常數。Cm、Csm（傳質阻力項）表征溶質在流動相和固定相之間分配。代入具體色譜相關參數，可表示為：

ω為柱內徑、填料性質相關的無因次常數，ε為固定相的孔隙度，k是組分的容量因子，γ為是與固定相顆粒、空道彎曲程度有關的系數，Dm為組分在流動相中的擴散系數。

上述公式可以看出，塔板高度（H）與填料粒徑（dp）有密切關聯，呈正向關系。

1.2 塔板數（N）和柱長（L）的關系

理論塔板數（N）是衡量色譜柱分離能力的指標，它與色譜柱長度（L）和塔板高度（H）之間存在一個簡單的反比關系：

N=L/H

因此要提高色譜柱的理論塔板數（即提高柱效）有2種途徑，一是增加色譜柱的長度，二是減小理論塔板高度。

綜合上述分析：理想條件下，色譜柱的理論塔板數與L/dp值呈正向關系，即N∝L/dp。即L/dp增大，色譜峰的理論板數增加；反之理論板數降低。

1.3 實際應用

 （1）增加色譜柱長

在填料粒徑（dp）不變的情況下，增加色譜柱的長度可提高L/dp比值，從而提高柱效。然而，這種方法的代價是分析時間會線性增加，柱壓也會相應升高。在現代儀器分析中，單純依靠增加柱長來提高柱效的做法使用較少。

（2）減小填料粒徑（dp）

在柱長（L）不變的情況下，使用更小粒徑的填料可以顯著提高L/dp比值，從而大幅提升柱效。例如，將粒徑從5μm減小到1.8μm，L/dp比值增加近3倍，柱效也隨之大幅提升。這是超高效液相色譜（UPLC）技術的核心，通過使用亞2μm的填料，實現傳統(tǒng)HPLC無法匹及的高分離度和高分析速度。

二、L/dp調整范圍的分析

實際工作中，不同廠家的色譜儀器、色譜柱生產工藝、填料粒徑往往存在差異，色譜條件參數在一定范圍內的靈活調整則顯得尤為重要，給分析方法實施增加了靈活性。

當L/dp比值在-25%至+50%之間變化時，意味著理論塔板數N也將在一定范圍內變化。這個“安全”范圍既能滿足大多數分離需求，又不會對方法的穩(wěn)健性造成過大影響。

（1）下限（-25%）

允許L/dp比值降低25%，意味著在某些情況下，可以接受柱效有小幅度的下降；對于從常規(guī)HPLC向UPLC轉換時尤為重要，因為UHPLC系統(tǒng)通常使用更短的色譜柱，即使粒徑更小，L/dp比值也可能略低于原始HPLC方法，比如原色譜柱L/dp（100mm/3μm）為33333，更換為L/dp（50mm/1.8μm）為27778。只要分離度和系統(tǒng)適用性不受影響，這種小幅度的柱效降低是可以接受的。

（2）上限（+50%）

允許L/dp比值增加50%，則為提高分離度提供了更大的空間。方法重現出現問題時，可以選擇更長或更小粒徑填料的色譜柱，以獲得更高的柱效和更好的分離效果，而無需重新進行方法摸索與全面的方法驗證。

這種規(guī)定既保證了方法的“底線”——即分離能力不會降低，又為方法的調整留下了充足的空間。同時為方法轉移提供了一個簡單而有效的“標尺”：只要新舊色譜柱的L/dp比值在規(guī)定的范圍內，系統(tǒng)適用性符合要求，就可以判定分離能力是基本等效的，從而極大提升了方法轉移的成功率。

三、填料粒徑對分離參數的影響分析

填料粒徑作為色譜柱的核心參數，其變化不僅影響柱效（塔板數N），還會對分離度、柱壓和分析時間等產生影響。在進行方法重現、甚至開發(fā)或優(yōu)化時，必須對這些影響進行全面的權衡，以找到最適合的色譜條件。

（1）分離度

衡量兩個色譜峰分離程度的首要指標，是方法開發(fā)中最重要的考量因素之一，它直接決定了分析結果的準確性和可靠性。

從分離度方程可以看出，分離度與理論塔板數的平方根成正比；增加柱效是一種改善分離度的方法。但是通過增加柱效來提高分離度存在“收益遞減”效應，分離度提高1倍，理論塔板數則需要增加到4倍。

（2）柱壓影響

根據泊肅葉定律（Poiseuille's Law），色譜柱的壓力（ΔP）與流動相的粘度（η）、流速（F）、柱長（L）成正比，與色譜柱內徑（dc）的4次方和填料粒徑（dp）的平方成反比。因此，當填料粒徑減小時，柱壓會以平方關系急劇增加，對色譜系統(tǒng)提出了較高的要求。

因此選擇色譜柱時，必須充分考慮儀器的耐壓能力。如果實驗室只有常規(guī)HPLC系統(tǒng)，2.7~5μm的填料是更為穩(wěn)妥的選擇。如果追求更高的分析速度和分離度，則需要使用UPLC系統(tǒng)，使用亞2μm的填料才能發(fā)揮其最大優(yōu)勢。

（3）分析時間

在L/dp可接受范圍內，允許使用更短的色譜柱。保持柱效（N）不變的情況下縮短分析時間，可以按比例減小柱長和粒徑。例如，原色譜柱150mm×5μm（L/dp=30）替換為50mm×1.8μm的色譜柱（L/dp≈27.8），其柱效基本相當，但柱長縮短了2/3，分析時間也相應縮短了約2/3。

四、在允許調整范圍內的選擇策略

在選擇填料粒徑時，不能孤立地看單一參數的影響，需綜合考慮柱效、柱壓、分析時間、成本和儀器兼容性等多個方面的平衡。

高柱效：通常需要小粒徑和長柱，但這會導致高柱壓和長分析時間。

短分析時間：通常需要短柱和高流速，可能會犧牲柱效，并導致高柱壓。

低柱壓：通常需要大粒徑和短柱，但這會犧牲柱效和/或延長分析時間。

在方法重現或者方法開發(fā)中，應根據需要選擇最佳平衡，如常規(guī)的含量測定，可優(yōu)先考慮分析速度，選擇短柱，并適當調整流速；對于多組分有關物質分離方法，則需要優(yōu)先考慮柱效，優(yōu)選小粒徑填料、適當柱長，分析時間可能適當延長。

值得關注的是使用小粒徑或表面多孔填充劑的色譜柱時，高效液相色譜儀的輸液泵性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；而梯度洗脫程序中的滯留體積的影響也應當同樣予以重視，如有必要需根據滯留體積增加等度平衡。因此，在選擇填料粒徑之前，必須對現有儀器的性能有一個清醒的認識，確保色譜柱與儀器系統(tǒng)之間能夠實現最佳的性能匹配。

L/dp值允許在-25%至+50%范圍內調整這一規(guī)定，與歐洲藥典（EP 2.2.46）和美國藥典（USP<621>）中的相關規(guī)定保持了高度的一致性和協(xié)調性，反映了中國藥典的色譜方法標準化國際化趨勢。靈活調整的限制范圍也體現了基于色譜分析理論的科學評判，具體實施過程中，需要把握好柱效與系統(tǒng)適應性之間的平衡關系，才能更好的發(fā)揮藥典規(guī)定的實際意義。