近年來，亞硝胺類雜質(zhì)在藥物中的存在引起了全球藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)、制藥工業(yè)界和學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。自2018年在沙坦類藥物中首次檢出N-亞硝基二甲胺（NDMA）和N-亞硝基二乙胺（NDEA）以來，亞硝胺問題已從最初關(guān)注小分子亞硝胺擴(kuò)展到更復(fù)雜的藥物物質(zhì)相關(guān)亞硝胺雜質(zhì)（NDSRIs）的評估與控制。這類雜質(zhì)不僅可能來源于原料藥合成過程中的試劑、溶劑或中間體，還可能在于制劑階段由含亞硝酸鹽的輔料引發(fā)亞硝化反應(yīng)生成。其強(qiáng)烈的誘變性和致癌性使其被ICH M7指南列為“關(guān)注隊(duì)列”（CoC），需控制在極低水平（如NDEA的每日可接受攝入量僅為26.5ng），這對分析方法、工藝控制和毒理學(xué)研究提出了極高要求。面對這一挑戰(zhàn)，工業(yè)界和科學(xué)界共同推動了一系列研究方法、控制策略和監(jiān)管建議的發(fā)展。
01、亞硝胺雜質(zhì)的形成與科學(xué)挑戰(zhàn)
亞硝胺的形成通常涉及二級胺與亞硝化劑（如亞硝酸鹽）在酸性條件下的反應(yīng)。雖然簡單二級胺的亞硝化反應(yīng)機(jī)制明確，但復(fù)雜胺類（如藥物分子中常見的烷基芳胺、含多官能團(tuán)胺類）可能發(fā)生競爭性反應(yīng)路徑，如C-亞硝化、O-亞硝化、硝化甚至脫胺反應(yīng)，導(dǎo)致非N-亞硝胺產(chǎn)物的生成。例如，某些電子豐富的烷基芳胺在鹽酸存在下易發(fā)生Fischer-Hepp重排，生成對位C-亞硝基產(chǎn)物；而某些多胺類化合物（如1,3,5-三苯氨基苯）在亞硝化條件下則選擇性生成C-亞硝基產(chǎn)物。此外，亞硝胺產(chǎn)物本身可能因結(jié)構(gòu)特性（如β-羥基取代）在水溶液中不穩(wěn)定，進(jìn)一步增加了評估的復(fù)雜性。
為系統(tǒng)評估復(fù)雜胺類形成亞硝胺的潛力，Ashworth等人提出了一套標(biāo)準(zhǔn)化的三重正交亞硝化條件，用于強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)：
● 條件1（醋酸/亞硝酸鈉體系）：在醋酸介質(zhì)中，pH較低，加入NaNO?，模擬酸性環(huán)境下的亞硝化。
● 條件2（鹽酸/亞硝酸鈉體系）：在pH 3–4的鹽酸緩沖液中，加入NaNO?，維持pH并監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。
● 條件3（有機(jī)溶劑/亞硝酸叔丁酯體系）：在非質(zhì)子溶劑（如DCM、ACN）中使用t-BuONO作為亞硝化試劑，模擬中性或無水質(zhì)子環(huán)境。
這些條件覆蓋了藥物生產(chǎn)過程中可能遇到的多種亞硝化場景，使用1.5當(dāng)量亞硝化劑，在室溫下反應(yīng)24小時，并通過LC-MS和NMR對產(chǎn)物進(jìn)行定性與定量分析。若在此類強(qiáng)化條件下仍無法生成或分離出亞硝胺，則可基于反應(yīng)性和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)論證該亞硝胺在實(shí)際工藝中形成的風(fēng)險(xiǎn)極低。
02、NDSRI的合成挑戰(zhàn)與穩(wěn)定性問題
即使亞硝胺在理論上可形成，其合成與純化仍面臨諸多挑戰(zhàn)。許多NDSRIs在溶液中可能以瞬態(tài)中間體形式存在，但難以分離純化，尤其是在含水體系中易分解。例如，N-亞硝基氫氯噻嗪在水溶液中迅速降解，這反而成為其在制劑中風(fēng)險(xiǎn)較低的佐證。
合成過程中還需注意避免引入其他誘變性雜質(zhì)，如C-硝基或C-亞硝基副產(chǎn)物、殘留亞硝酸鹽、或其他胺類雜質(zhì)。色譜純化中使用的胺類添加劑（如三乙胺）可能與環(huán)境中的亞硝酸鹽反應(yīng)生成小分子亞硝胺，進(jìn)而污染目標(biāo)產(chǎn)物。此外，亞硝胺類化合物可能存在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)現(xiàn)象（如s-cis與s-trans構(gòu)型），在NMR和LC-MS等分析中呈現(xiàn)復(fù)雜信號，對純度和雜質(zhì)鑒定提出更高要求。
值得注意的是，某些亞硝胺在固態(tài)下穩(wěn)定性良好（如7種NDSRIs在5°C下存放20–27個月仍保持>98%純度），但在溶液中可能迅速降解。因此，若擬用于毒理學(xué)研究（如Ames試驗(yàn)），需提前考察其在載體溶劑中的穩(wěn)定性，避免假陽性結(jié)果。
03、ICH M7控制策略在亞硝胺管理中的應(yīng)用
ICH M7提出了四種控制致突變雜質(zhì)的策略：
策略1：在原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中列入雜質(zhì)檢測，接受標(biāo)準(zhǔn)低于可接受限度；
策略2：在原料、起始物料或中間體質(zhì)控或過程控制；
策略3：在上游物料（原料、起始物料或中間體）中控制，結(jié)合加標(biāo)-清除試驗(yàn)論證下游無需檢測；
策略4：完全基于工藝過程和科學(xué)原理（如清除計(jì)算）論證雜質(zhì)水平低于AI，無需分析檢測。
盡管策略4已廣泛用于非CoC雜質(zhì)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)曾對亞硝胺類雜質(zhì)是否適用該策略表示疑慮，原因包括：
● 亞硝胺的潛在效力更高，需控制至更低水平；
● 早期某些清除評估過于樂觀，與實(shí)際檢測結(jié)果不符。
然而，隨著對亞硝胺物化性質(zhì)（揮發(fā)性、反應(yīng)性、溶解度）和形成機(jī)制的深入理解，以及行業(yè)最佳實(shí)踐的形成（如Mirabilis方法輔助的清除計(jì)算），策略4的科學(xué)性和保守性逐步得到驗(yàn)證。以下通過典型案例說明其應(yīng)用：
案例1：嗎啉類亞硝胺的風(fēng)險(xiǎn)控制
某API合成中使用N-甲基嗎啉（含嗎啉雜質(zhì)≤0.1%）。通過清除計(jì)算預(yù)測嗎啉在API中的水平可降至37ppb，進(jìn)一步假設(shè)其在制劑中完全亞硝化為N-亞硝基嗎啉（AI=109ng/day），也僅占AI的4.5%。實(shí)驗(yàn)室加標(biāo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)嗎啉的清除因子超過13,000，遠(yuǎn)高于預(yù)測值。該策略最終被多個監(jiān)管機(jī)構(gòu)接受。
案例2：三乙胺（TEA）中二乙胺（DEA）的控制
TEA中DEA含量≤0.1%，但其在API合成中經(jīng)多步純化（結(jié)晶、洗滌、干燥）后，預(yù)測API中DEA≤1 ppb，對應(yīng)NDEA水平＜1.2 ppb（＜1ng/day）。實(shí)際檢測結(jié)果支持這一預(yù)測，NDEA未檢出。
案例3：溶劑DMF和NMP相關(guān)的亞硝胺風(fēng)險(xiǎn)
DMF可能降解產(chǎn)生二甲胺（DMA），進(jìn)而形成NDMA；NMP可能形成4-甲氨基丁酸（MBA）及其亞硝化物（NMBA）。通過理論清除計(jì)算和實(shí)驗(yàn)加標(biāo)（100 ppm），證明API中NDMA和NMBA水平＜5 ppb，遠(yuǎn)低于控制限（100 ppb）。累計(jì)清除因子達(dá)10?級別，支持策略4控制。
案例4：最終反應(yīng)步驟中形成的亞硝胺
某API最終步驟涉及疊氮化物與亞硝酸鈉反應(yīng)，存在NDMA和NDEA形成風(fēng)險(xiǎn)。通過理論清除（2.43×10?）結(jié)合驗(yàn)證批次檢測，證實(shí)API中亞硝胺未檢出（LOD≈3% AI），策略4策略獲監(jiān)管接受。
04、清除評估的科學(xué)基礎(chǔ)與保守性驗(yàn)證
清除計(jì)算基于雜質(zhì)的反應(yīng)性、溶解度和揮發(fā)性三項(xiàng)參數(shù)，每步工藝賦予相應(yīng)的清除因子（通常1–10）。最佳實(shí)踐強(qiáng)調(diào)保守賦值，例如：
● 僅對漿洗操作賦予有限清除（通常≤3）；
● 不考慮非漿洗操作的清除；
● 避免對揮發(fā)性和反應(yīng)性過度樂觀。
多數(shù)案例顯示，理論清除因子顯著低于實(shí)際清除能力（幅度可達(dá)10-1000倍），這種保守性為策略4策略提供了堅(jiān)實(shí)支撐。此外，分子量校正、加標(biāo)實(shí)驗(yàn)、批次檢測數(shù)據(jù)等進(jìn)一步增強(qiáng)了論證的說服力。
05、結(jié)論與展望
亞硝胺雜質(zhì)的管理是當(dāng)今制藥行業(yè)面臨的一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)，但其科學(xué)基礎(chǔ)和控制手段已日益成熟。通過標(biāo)準(zhǔn)化亞硝化條件評估形成潛力，結(jié)合清除計(jì)算和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可科學(xué)論證亞硝胺在藥物中的風(fēng)險(xiǎn)可控性。ICH M7策略4不僅適用于胺前體的控制，也適用于亞硝胺本身的實(shí)際清除，只要其預(yù)測保守、數(shù)據(jù)充分、論證嚴(yán)謹(jǐn)。
未來，隨著更多數(shù)據(jù)的積累和建模工具的優(yōu)化，行業(yè)對亞硝胺行為的理解將進(jìn)一步深化，監(jiān)管接受度也有望提高。然而，企業(yè)仍需保持高度謹(jǐn)慎，持續(xù)優(yōu)化工藝設(shè)計(jì)、強(qiáng)化原材料控制、開發(fā)高靈敏度分析方法，并在必要時采用組合策略（如策略3+策略4），最終確保患者用藥安全。
參考文獻(xiàn)：
[1] Ian W. Ashworth, et al. Org. Process Res. Dev. 2023, 27, 1784-1791.
[2] M. W. Urquhart, et al. Org. Process Res. Dev. 2025, 29, 1152-1167.
[3] ICH M7(R2). Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk.
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