革蘭氏染色（Gram Stain）是微生物學(xué)中一項至關(guān)重要且應(yīng)用廣泛的鑒別染色技術(shù)，由丹麥細(xì)菌學(xué)家漢斯·克里斯蒂安·革蘭于1884年發(fā)明。它通過將細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌（G?）和革蘭氏陰性菌（G?）兩大類，為細(xì)菌的初步鑒定、抗生素的選擇及疾病診斷提供關(guān)鍵依據(jù)。本文將詳細(xì)解析革蘭氏染色的標(biāo)準(zhǔn)四步操作法，并深入探討常見問題及其解決方案。
一、 基本原理
革蘭氏染色的差異源于細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的不同。
革蘭氏陽性菌（G?）：細(xì)胞壁厚，富含肽聚糖和磷壁酸，結(jié)構(gòu)致密。在經(jīng)過乙醇或丙酮脫色時，肽聚糖層脫水收縮，使得結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被牢牢鎖在細(xì)胞壁內(nèi)，不易被洗脫，因此最終呈現(xiàn)紫色或藍(lán)色。
革蘭氏陰性菌（G?）：細(xì)胞壁薄，肽聚糖層較薄，但外膜含有豐富的脂多糖和脂質(zhì)。脫色劑能溶解外膜的脂質(zhì)，破壞細(xì)胞壁完整性，形成孔隙，從而使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物極易被洗脫。當(dāng)復(fù)染劑沙黃或品紅加入后，細(xì)胞便被染成紅色或粉色。
二、 實驗材料與試劑
1、菌種：待測細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物（通常為18-24小時菌齡）。
2、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、洗瓶、顯微鏡。
3、四種關(guān)鍵試劑（按使用順序）：
初染劑：結(jié)晶紫（Crystal Violet）
媒染劑：路哥氏碘液（Lugol's Iodine）
脫色劑：95%乙醇（Ethanol）或丙酮-乙醇混合液
復(fù)染劑：沙黃（Safranin）或稀釋石炭酸品紅（Carbol Fuchsin）
三、 標(biāo)準(zhǔn)四步操作法
第一步：涂片、固定
1、制備涂片：取一滴無菌水或生理鹽水于載玻片中央，用無菌接種環(huán)挑取少量菌落，均勻涂布成直徑約1厘米的薄層膜。
2、風(fēng)干：在空氣中自然風(fēng)干。
3、熱固定：將涂有菌膜的一面朝上，快速通過酒精燈火焰2-3次。此步驟旨在殺死細(xì)菌并使其牢固附著在玻片上，但需避免過度加熱導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變。
第二步：結(jié)晶紫初染
1、用結(jié)晶紫染液覆蓋菌膜，染色1分鐘。
2、用緩流自來水輕輕沖洗，洗去多余染液，甩干玻片上多余水分。
第三步：碘液媒染
1、用路哥氏碘液覆蓋菌膜，染色1分鐘。
2、碘液作為媒染劑，能與結(jié)晶紫形成分子量更大、溶解度更低的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物（CV-I Complex）。
3、再次用緩流自來水輕輕沖洗，甩干。
第四步：乙醇脫色（最關(guān)鍵的一步）
1、將載玻片傾斜，用95%乙醇滴流沖洗涂片，直至流下的乙醇幾乎無色（此過程通常僅需5-15秒，具體時間需經(jīng)驗判斷）。
2、立即用緩流水輕輕沖洗，終止脫色。
第五步：沙黃復(fù)染
1、用沙黃染液覆蓋菌膜，復(fù)染30秒至1分鐘。
2、用緩流自來水沖洗干凈，用吸水紙輕輕吸干或自然風(fēng)干。
鏡檢：待玻片完全干燥后，在油鏡下（100×物鏡）觀察。紫色為革蘭氏陽性菌（G?），紅色為革蘭氏陰性菌（G?）。
四、 常見問題解析（QA）
Q1：脫色環(huán)節(jié)如何把握？時間太短或太長會怎樣？
問題：脫色是革蘭氏染色中最需要經(jīng)驗的一步，難以精確計時。
影響：
脫色不足：如果乙醇作用時間太短，所有細(xì)菌（包括G?菌）的CV-I復(fù)合物都未被充分洗脫，在復(fù)染后G?菌也可能呈現(xiàn)紫色，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
脫色過度：如果乙醇作用時間太長，G?菌細(xì)胞壁中的CV-I復(fù)合物也會被部分或全部洗脫，隨后被染成紅色，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
解決方案：采用滴流法而非浸泡法，并密切觀察流出液的顏色，當(dāng)其從深紫色變?yōu)榈仙驘o色時立即停止。新手可用已知的G?（如金黃色葡萄球菌）和G?（如大腸桿菌）菌株做對照練習(xí)。
Q2：為什么會出現(xiàn)“革蘭氏可變性”或結(jié)果不明確？
菌齡問題：使用老齡細(xì)菌（培養(yǎng)超過24-48小時）時，G?菌的細(xì)胞壁可能受損，肽聚糖降解，導(dǎo)致脫色時染料泄漏而呈紅色或紫色不均勻（革蘭氏可變性）。
涂片過厚：菌膜過厚會使脫色劑無法均勻作用，內(nèi)部細(xì)菌脫色不充分，可能導(dǎo)致G?菌核心呈紫色，外圍呈紅色。
解決方案：始終使用18-24小時內(nèi)的新鮮培養(yǎng)物制備薄而均勻的涂片。
Q3：染色結(jié)果中背景有沉淀或雜質(zhì)怎么辦？
問題：視野中有大量顆粒狀沉淀，影響觀察。
原因：通常是染液沉淀或涂片清洗不徹底所致。
解決方案：確保所有染液經(jīng)過過濾且無沉淀；每一步?jīng)_洗后應(yīng)充分甩干玻片上的積水，再進(jìn)行下一步操作。
Q4：熱固定時需要注意什么？
問題：固定不牢或細(xì)胞變形。
影響：固定不牢會導(dǎo)致菌體在染色沖洗過程中被沖走；過度加熱會使細(xì)胞扭曲、破裂，影響形態(tài)觀察和染色結(jié)果。
解決方案：將玻片在火焰上以不燙手背的溫度快速通過2-3次即可。
Q5：鏡檢時視野中找不到細(xì)菌或細(xì)菌數(shù)量很少？
原因：可能因涂片時菌量取得太少，或沖洗步驟水流過猛將菌膜沖掉。
解決方案：挑取適量菌苔，確保涂片有足夠的細(xì)菌密度；所有沖洗步驟必須使用緩流的水，并讓水從玻片一端流下，避免直接沖刷菌膜區(qū)域。
結(jié)語
掌握革蘭氏染色技術(shù)需要理論與實踐相結(jié)合。嚴(yán)格遵循“四步法”的操作規(guī)程，特別是控制好菌齡、涂片厚度和脫色時間這三個關(guān)鍵點，同時注意細(xì)節(jié)，就能獲得清晰、可靠的染色結(jié)果，為后續(xù)的微生物鑒定工作打下堅實的基礎(chǔ)。
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