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培養(yǎng)基問題（最常見的原因之一）

01成分錯誤或缺失

配制時稱量錯誤，漏加某種關(guān)鍵成分（如碳源、氮源、生長因子）。

使用了不合適的培養(yǎng)基，該菌種有特殊的營養(yǎng)要求（如需要添加血液、血清、特定維生素或氨基酸）。

02pH值不當(dāng)

培養(yǎng)基滅菌前后的pH值發(fā)生變化未校正。

 菌種生長所需的最適pH范圍很窄，當(dāng)前pH不適合。

培養(yǎng)基配制后存放過久，吸收CO?導(dǎo)致pH下降。

03選擇性過強(qiáng)/含有抑制劑

如果使用的是選擇性培養(yǎng)基，其中的抗生素或其他抑制劑濃度過高，或者混勻不均，導(dǎo)致局部濃度過高抑制生長。

 抑制劑失效（如抗生素過期）導(dǎo)致雜菌過度生長，抑制了目標(biāo)菌。

04凝固劑問題

瓊脂濃度過高，影響營養(yǎng)擴(kuò)散和菌種生長。

 瓊脂本身含有抑制物（較少見）

05滅菌不當(dāng)

過度滅菌： 高溫高壓時間過長，導(dǎo)致培養(yǎng)基成分被破壞（如糖類焦化、維生素分解、瓊脂降解）。

滅菌不徹底： 培養(yǎng)基含有耐熱雜菌，與目標(biāo)菌競爭營養(yǎng)或產(chǎn)生毒素。

 

培養(yǎng)環(huán)境問題

01溫度不適宜

培養(yǎng)箱溫度不準(zhǔn)、不穩(wěn)定或溫度分布不均。

不了解菌種的最適生長溫度（如嗜冷菌、嗜熱菌、中溫菌）。

02氣體條件不符

 需氧菌： 培養(yǎng)容器密封過嚴(yán)，或接種物埋得過深，導(dǎo)致缺氧。

 厭氧菌： 厭氧環(huán)境創(chuàng)建失?。ㄈ鐓捬豕?袋漏氣、催化劑失效、厭氧指示劑未達(dá)標(biāo)）。

 微需氧菌/苛養(yǎng)菌： 未提供特定的氣體環(huán)境（如5-10% CO?， 如彎曲桿菌、腦膜炎球菌）。

CO?培養(yǎng)箱： CO?濃度設(shè)置錯誤或傳感器校準(zhǔn)失效。

03濕度不足

培養(yǎng)箱內(nèi)濕度太低，導(dǎo)致培養(yǎng)基（尤其是平板）干燥，影響菌體水分吸收。

 

操作技術(shù)問題

01接種物問題

接種量不足： 挑取的菌苔或菌落太少。

接種物狀態(tài)不佳： 使用了過于衰老的菌液或處于穩(wěn)定期/衰亡期的菌種。

 凍干菌種或冷凍菌種復(fù)蘇不當(dāng)： 未進(jìn)行充分復(fù)蘇或傳代，直接接種到固體培養(yǎng)基上。

02接種過程損傷

接種針溫度過高，燙死了菌種。

 在熱接種區(qū)域操作時，熱輻射導(dǎo)致菌種死亡。

03培養(yǎng)時間不足

有些菌種生長非常緩慢（如某些放線菌、真菌），需要培養(yǎng)數(shù)天甚至數(shù)周，觀察時間過短。

04污染

菌種被其他快速生長的微生物（如霉菌、細(xì)菌）完全覆蓋，無法觀察到目標(biāo)菌落。

 

菌種保存與復(fù)蘇問題

01保藏不當(dāng)

 反復(fù)凍融或保存溫度不穩(wěn)定（如-20℃冰箱開關(guān)頻繁）。

 甘油管保存時，甘油濃度不當(dāng)或未充分混勻。

 菌種保藏時間過長，活力下降。

02復(fù)蘇流程錯誤

從超低溫（-80℃）或液氮中取出后，未在合適溫度（如37-40℃水?。┛焖購?fù)蘇。

復(fù)蘇后直接劃板，而未先接種在液體培養(yǎng)基中富集。

 

檢測與觀察方法問題

01觀察方法不當(dāng)

菌落非常微小、透明或嵌入瓊脂內(nèi)部，肉眼難以觀察，需要借助解剖鏡或進(jìn)行染色鏡檢。

某些菌種在固體培養(yǎng)基上就是不長成典型菌落，而是形成一層薄膜或擴(kuò)散生長。

02染色或鏡檢錯誤

 染色液失效或操作不當(dāng)，導(dǎo)致假陰性。

 鏡檢時未找到菌體。

 

系統(tǒng)排查建議

當(dāng)遇到菌種長不出的情況時，建議按照以下步驟進(jìn)行排查：

設(shè)立陽性對照： 使用一種已知的、生長良好的類似菌種，在相同培養(yǎng)基和條件下同時培養(yǎng)。如果對照能生長，則問題出在目標(biāo)菌種本身或其接種物上；如果對照也不長，則問題出在培養(yǎng)基、環(huán)境或通用操作上。

鏡檢確認(rèn)： 對接種物進(jìn)行染色鏡檢，確認(rèn)是否有活菌存在。

多媒介培養(yǎng)： 同時使用營養(yǎng)更豐富的培養(yǎng)基（如血平板）和通用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，看是否因營養(yǎng)苛求所致。

檢查設(shè)備： 校準(zhǔn)培養(yǎng)箱的溫度和CO?濃度，檢查厭氧罐的氣密性。

 回顧操作： 仔細(xì)檢查從培養(yǎng)基配制、滅菌、接種到培養(yǎng)的每一個步驟，確認(rèn)是否有偏離標(biāo)準(zhǔn)操作程序的地方。