小鼠淋巴細(xì)胞是其免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）。
T細(xì)胞分為輔助性T細(xì)胞（CD4+）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+），分別在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和直接殺傷感染細(xì)胞中發(fā)揮作用。B細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗體和抗原呈遞，而NK細(xì)胞則通過(guò)識(shí)別和消滅異常細(xì)胞快速響應(yīng)感染和腫瘤。
這些淋巴細(xì)胞廣泛分布在小鼠的脾臟、淋巴結(jié)、胸腺和骨髓等組織中，是免疫學(xué)研究的主要模型，有助于理解人類的免疫機(jī)制。
脾臟作為重要的免疫器官之一，含有豐富的淋巴細(xì)胞，占全身淋巴組織的25%。由于小鼠的血液量較少，從外周血中難以分離出足夠的淋巴細(xì)胞，因此通常需要從小鼠的脾臟中獲取大量的淋巴細(xì)胞。
一、實(shí)驗(yàn)步驟
1 準(zhǔn)備材料和試劑
a.選擇成年小鼠，確保其具有正常的免疫功能。
b.斷頸處死小鼠，并將小鼠尸體浸泡在75%酒精中進(jìn)行消毒處理。
c.準(zhǔn)備已消毒的眼科剪刀和鑷子，無(wú)菌6 cm培養(yǎng)皿、冰PBS。
2 處理小鼠脾臟
a.用剪刀和鑷子取出小鼠的脾臟，置于含有冰冷PBS的培養(yǎng)皿中。
b.將脾臟放在70 µm細(xì)胞篩網(wǎng)或200目的尼龍網(wǎng)上（尼龍網(wǎng)更柔和，有利于提高細(xì)胞存活率）。
c.使用5 mL注射器的活塞在篩網(wǎng)上輕輕研磨脾臟，逐步加少量冰PBS，直至脾臟完全被研磨成細(xì)胞懸液。將通過(guò)篩網(wǎng)的細(xì)胞懸液收集到15 mL離心管中。
3、離心
a.在一個(gè)15 mL的離心管中，首先加入5 mL的Ficoll分離液。然后將管子傾斜，輕輕地將含有淋巴細(xì)胞的PBS緩慢倒入Ficoll分離液中。此時(shí)，會(huì)觀察到明顯的液體分層現(xiàn)象。(有資料提示在加入Ficoll分離液之前，可以先在細(xì)胞懸液上方輕輕加入200 µL的1640培養(yǎng)基作為覆蓋層，這樣有利于離心后讓淋巴細(xì)胞在分離界面上聚集 )
b.接下來(lái)，以800 x g的速度進(jìn)行梯度離心25 min，如果離心機(jī)提供升降速檔位設(shè)置，可以把升速和降速均設(shè)置為3。離心結(jié)束后，液體將分成三層。
c.隨后，小心地吸取中間層的液體（其中含有淋巴細(xì)胞和少量紅細(xì)胞），轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的15 mL離心管中，并補(bǔ)充PBS，再次以800 x g離心5 min。
d.離心后，棄上清，加入1~2 mL的紅細(xì)胞裂解液，在冰上處理5 min。最后，再補(bǔ)充PBS，以800 x g離心5分鐘。
e.棄上清, 可見(jiàn)白色沉淀，此時(shí)沉淀為總淋巴細(xì)胞。一只成年小鼠的脾臟通?？梢蕴崛〖s2~6 x 10^7個(gè)淋巴細(xì)胞。
二、注意事項(xiàng)
每處理完一只小鼠的脾臟，應(yīng)立即將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管并關(guān)緊管蓋，以防液體揮發(fā)造成滲透壓改變。
使用Ficoll溶液進(jìn)行離心分層后，血液成分會(huì)按密度梯度重新排列。血漿和血小板由于密度較低，會(huì)浮在分層液的上部；PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）的密度稍低于Ficoll溶液，因此在界面處形成一層白膜；而紅細(xì)胞和粒細(xì)胞因密度較高，會(huì)沉積在分層液的底部。
離心結(jié)束后，從管底往上依次是紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、Ficoll細(xì)胞分離液、淋巴細(xì)胞、血小板和血漿。
在提取淋巴細(xì)胞時(shí)，需要小心地移除上層的血漿和血小板，然后再吸取位于界面處的淋巴細(xì)胞層。
以上方法獲得的是總淋巴細(xì)胞，如果需要進(jìn)一步純化獲得T、B細(xì)胞，需要采用免疫磁珠分選。
梯度離心時(shí)要小心吸取中間層的細(xì)胞懸液，盡量避免吸入上層和下層的液體。
加入紅細(xì)胞裂解液后，應(yīng)在冰上處理5 min，以提高裂解效果并保持細(xì)胞活性。處理結(jié)束后立即補(bǔ)充PBS并進(jìn)行離心，以去除裂解后的紅細(xì)胞殘?jiān)?/span>
上述所有步驟都必須在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，使用無(wú)菌試劑和耗材。
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