本試驗(yàn)以高效率液相色譜 (HPLC)、超高效液相色譜質(zhì)譜 (UPLC-MS)、紅外光譜 (IR) 等現(xiàn)代分析技術(shù)，測(cè)定川芎生品及其炮制品中所含活性成分含量，并結(jié)合炮制時(shí)化學(xué)成分轉(zhuǎn)化規(guī)律、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)變化、體內(nèi)生物利用度變化等方面展開(kāi)全面分析。從上述研究可知，炮制會(huì)顯著提高川芎中活性成分的提取率，且該過(guò)程與炮制引起成分結(jié)構(gòu)的變化、細(xì)胞破壁通透性以及體內(nèi)代謝等方面改變有關(guān)，為合理炮制川芎的有效使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
??Part1引言
川芎作為我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥材（見(jiàn)圖 1），資源豐富，可以廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病以及各類疼痛、痛經(jīng)疾病的治療。其主要活性成分包括川芎嗪、阿魏酸、白木脂素以及多種揮發(fā)油和酚酸類化合物。傳統(tǒng)的炮制法如酒炙、醋炙、麩炒等都對(duì)川芎藥性及療效有一定的影響 [1]。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的快速發(fā)展，深入研究不同炮制方法對(duì)川芎中有效成分提取率及作用機(jī)理的影響，不僅有助于闡明傳統(tǒng)炮制理論的科學(xué)內(nèi)涵，更能為優(yōu)化川芎炮制工藝、提升其藥用價(jià)值提供重要依據(jù)。
圖 1 中藥材川芎
Part2傳統(tǒng)與現(xiàn)代視角下川芎的炮制方法及研究技術(shù)
2.1 川芎的傳統(tǒng)炮制方法
傳統(tǒng)上，川芎有酒炙、醋炙、麩炒等多種炮制方法。酒炙川芎是指取凈川芎片加入一定量黃酒拌勻，悶潤(rùn)后炒干，其目的是用酒的辛熱之性來(lái)增強(qiáng)川芎活血通絡(luò)的作用；醋炙川芎先將米醋加入川芎片中充分拌和后用文火炒至一定程度即可；麩炒川芎將川芎加入麥麩中用文火炒到一定程度再取出，放入篩內(nèi)揚(yáng)去麥麩，這樣可使藥性得到緩和，而且能減去部分辛燥之性，又可增強(qiáng)藥物健脾和胃的作用（見(jiàn)圖 2）。這些傳統(tǒng)的炮制方法在臨床上雖有許多寶貴的經(jīng)驗(yàn)，但是沒(méi)有涉及到其中所含活性成分的改變以及其改變的原因 [2]。
圖 2 中藥炒藥機(jī)
2.2 現(xiàn)代研究技術(shù)手段
2.2.1 色譜技術(shù)
高效液相色譜（HPLC）（見(jiàn)圖 3）可用于研究川芎的有效成分。如用反相C18 色譜柱，以甲醇 - 水 - 冰醋酸作為流動(dòng)相可以很好地完成阿魏酸、川芎內(nèi)酯等酚酸類成分的分離和測(cè)定。同時(shí)通過(guò)控制流速、柱溫和檢測(cè)波長(zhǎng)等色譜條件，獲得較好的分離效果，并且實(shí)現(xiàn)了多個(gè)活性成分的同時(shí)定量測(cè)定，該方法具有較高的分離效率、較高的靈敏度和良好的重現(xiàn)性等特點(diǎn)，在川芎活性成分的分析上起著較大的作用。
圖 3 高效液相色譜儀
超高效液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用（UPLCMS）（見(jiàn)圖 4）集 UPLC 高效性及 MS 高靈敏度、特異性的優(yōu)勢(shì)于一身，具有靈敏度高、峰容量大等特點(diǎn)，可用于短時(shí)間內(nèi)完成川芎復(fù)雜化學(xué)成分的快速分離鑒定工作，可測(cè)得已知活性成分含量也可檢出一些微量的未知成分，對(duì)于后續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展川芎化學(xué)成分研究具有重要的價(jià)值意義。如在分析川芎嗪以及川芎嗪代謝物時(shí)可以用 UPLC-MS 準(zhǔn)確測(cè)定出川芎嗪在體內(nèi)含量的變化以及代謝途徑。
圖 4 超高效液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用
2.2.2 光譜技術(shù)
紅外光譜（IR）（見(jiàn)圖 5）可用于探討川芎炮制前后其化學(xué)成分官能團(tuán)的轉(zhuǎn)變情況，活性成分有不同的吸收峰，因此通過(guò)不同藥材炮制過(guò)程中這些吸收峰的位置、強(qiáng)度的變化就可以推測(cè)該成分發(fā)生了怎樣的變化。比如，阿魏酸具有羥基、苯環(huán)等官能團(tuán)，在紅外光譜中有對(duì)應(yīng)的特征吸收峰，在炮制過(guò)程后的吸收峰的位移或強(qiáng)度的變化說(shuō)明了其中的阿魏酸含量也發(fā)生了變化。
圖 5 紅外光譜儀
利用核磁共振（NMR）對(duì)川芎的內(nèi)源性化學(xué)成分提供更詳盡精準(zhǔn)的信息，通過(guò)測(cè)定 1H-NMR 譜和 13C-NMR譜，獲取化合物中氫原子、碳原子的化學(xué)環(huán)境信息及相互間的連接關(guān)系，鑒定川芎的活性成分。對(duì)研究炮制作用下，川芎化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變有重要意義，如判斷川芎嗪是否有甲基化反應(yīng)、氧化反應(yīng)等的發(fā)生情況。
Part3川芎炮制過(guò)程對(duì)其內(nèi)部活性成分提取率所產(chǎn)生的影響
3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
3.1.1 材料來(lái)源
挑選新鮮的川芎根莖，經(jīng)鑒定確認(rèn)屬于傘形科植物川芎，其采購(gòu)來(lái)源為四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。炮制所用的黃酒、米醋、麥麩等輔料均符合藥用標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自河南盛潤(rùn)藥材有限公司。
3.1.2 炮制方法
（1）酒炙川芎的炮制步驟如下：取100 g 川芎片，添加 20 g 黃酒并攪拌均勻，隨后密封燜潤(rùn) 1 h，再放置到炒制容器里，采用文火翻炒直至干燥，最后取出放涼；
（2） 醋炙川芎：取川芎片 100 g，加入15 g 米醋拌勻，悶潤(rùn)30 min，用中火炒至表面微焦，取出晾涼；
（3）麩炒川芎的操作流程為：首先把10 g 麥麩撒入預(yù)先加熱 好 的 炒 制 容 器 中，待麥麩冒煙時(shí)，加入100 g 川芎片，運(yùn)用中火炒制，直至川芎表面呈現(xiàn)黃色，接著取出，篩除麥麩后冷卻。
3.1.3 活性成分提取與測(cè)定
（1）運(yùn)用超聲輔助提取法提取川芎中有效成分，取川芎生品及各炮制品粉末 ( 過(guò)四號(hào)篩 )1g, 置于具塞錐形瓶中，加入 70%乙醇溶液 20 mL, 超聲提取 40 min( 超聲功率 300 W、頻率40 kHz), 所得提取液經(jīng)濾過(guò)，濾液定容至 50 mL ；
（2）以 HPLC 法測(cè)定阿魏酸含量：用 C18 柱 (4.6 mm×250 mm、5 μm)，以甲醇 -0.1% 冰醋酸溶液 (30 ：70，V/V) 為流動(dòng)相，流速 1 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm, 柱溫 30℃。進(jìn)樣量 20 μL ；
（3）采用 UPLC-MS 法測(cè)定了川芎嗪含量。選用 ACQUITY UPLC BEHC18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 色譜柱；流動(dòng)相為乙腈 -0.1% 甲酸溶液 (40 ：60，v/v)，流速為 0.3 mL/min; 電噴霧離子源 (ESI)，正離子模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓 3 kV，錐孔電壓 30 V，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度 400℃，脫溶劑氣流量 600 L/h, 錐孔氣流量 50 L/h, 取樣品進(jìn)樣量為 5 μL。
3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
3.2.1 不同的炮制品中活性成分含量變化
表 1、表 2 可知，與川芎生品相比，酒炙川芎中川芎嗪的含量明顯升高（從 1.20 mg/g 升至 1.60 mg/g），提高約25%，其原因可能是酒能促進(jìn)川芎嗪前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為川芎嗪，或使川芎嗪的穩(wěn)定性得到改善，利于川芎嗪在提取過(guò)程中的溶出；但阿魏酸的含量略有降低( 從 0.50 mg/g 降至 0.45 mg/g), 降低約10% 左右，可能是部分阿魏酸發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為其它衍生物所致。
表 1 川芎嗪含量對(duì)比結(jié)果
表 2 阿魏酸含量對(duì)比結(jié)果
醋炙川芎中阿魏酸含量升高，由0.50 mg/g 增至 0.65 mg/g，增幅約 30%，這是由于醋中含有的酸類成分能促進(jìn)川芎中結(jié)合型阿魏酸的水解轉(zhuǎn)化成為游離型阿魏酸的緣故，可以提高阿魏酸的提取率；而川芎嗪含量在醋炙川芎中略有下降，由 1.20 mg/g 降至 1.02 mg/g，降幅為 15% 左右，可能是由于該物質(zhì)分子中存在三對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體中的一種所導(dǎo)致的。
麩炒川芎的川芎嗪、阿魏酸含量均有所降低，川芎嗪含量由 1.20 mg/g降為 0.96 mg/g，降低約 20% ；阿魏酸由 0.50 mg/g 降為 0.41 mg/g，降低約18%，可能與麩炒過(guò)程中高溫及麥麩有關(guān)，使得部分有效成分發(fā)生分解或者與其它成分形成絡(luò)合物的原因。
3.2.2 炮制工藝相關(guān)參數(shù)對(duì)活性成分提取率的作用影響
經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究得出，酒炙時(shí)黃酒量以及炒制溫度均會(huì)對(duì)川芎嗪和阿魏酸的提取率產(chǎn)生明顯的影響。黃酒量控制在川芎片重量的 20% ～ 30%時(shí)，川芎嗪的提取率最高；炒制溫度在120 ～ 150℃時(shí)有利于川芎嗪的溶出，但是溫度太高會(huì)使得阿魏酸發(fā)生降解。
在醋炙過(guò)程中，米醋的加入量和悶潤(rùn)時(shí)間均會(huì)對(duì)其中有效成分的提取率產(chǎn)生影響，在此實(shí)驗(yàn)中，在米醋加入量占川芎片重 15% ～ 20%，悶潤(rùn)時(shí)間為30 ～ 60 min 時(shí)有利于阿魏酸的提取，并且可減少川芎嗪的損失。
在麩炒時(shí)，麥麩用量和炒制時(shí)長(zhǎng)是 2 個(gè)重要的影響因素。麥麩用量一般取川芎片重的 10% ～ 15%，炒制時(shí)間在 5 ～ 10 min 時(shí)有利于降低有效成分的損耗。
Part4炮制影響川芎中活性成分提取率的機(jī)制探討
4.1 化學(xué)成分結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化機(jī)制
炮制促使川芎化學(xué)成分結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。如川芎嗪于酒炙時(shí)，因酒中乙醇作甲基供體，可發(fā)生甲基化反應(yīng)形成甲基川芎嗪等衍生物，化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)改變，提取率受影響。而阿魏酸在醋炙的酸性條件下，一方面酯鍵水解，結(jié)合型轉(zhuǎn)為游離型，極性與溶解性改變使提取率升高；另一方面還可能與醋成分酯化生成新酯類衍生物，其提取率有別，進(jìn)而影響阿魏酸類整體提取狀況 [3]。
4.2 細(xì)胞破壁及通透性改變機(jī)制
通過(guò)炮制加溫或加入輔料后可使川芎的細(xì)胞發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，如炒制過(guò)程中產(chǎn)生的高溫能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部的水分蒸發(fā)、細(xì)胞膨脹破裂，使細(xì)胞壁變得破壞，并且由于該種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化可以讓細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)得到更好的釋放，提高浸出效率。而酒炙、醋炙的輔料經(jīng)滲透作用可影響細(xì)胞膜的通透性，如酒中含有乙醇、醋中含有的醋酸等小分子物類物質(zhì)可滲透入細(xì)胞，使細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，一方面使得有效成分溶解度增大；另一方面破壞了細(xì)胞內(nèi)有效成分與其他物質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)，使其更易溶出。
4.3 體內(nèi)生物利用度改變機(jī)制
炮制后川芎體內(nèi)的生物利用度會(huì)發(fā)生變化，對(duì)其藥效和活性成分發(fā)揮作用的效果產(chǎn)生一定的影響。如酒炙川芎中川芎嗪含量增高，結(jié)構(gòu)有改變，這樣會(huì)使川芎嗪在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄等發(fā)生一定的變化；還有甲基川芎嗪等衍生物具有較好的脂溶性，容易透過(guò)生物膜，進(jìn)入血液循環(huán)，提高其在體內(nèi)的生物利用度。
醋炙川芎中游離態(tài)阿魏酸增加，游離態(tài)阿魏酸較結(jié)合態(tài)阿魏酸易通過(guò)胃腸道吸收進(jìn)入血液，在體內(nèi)起到較好的抗氧化、抗炎作用；阿魏酸在體內(nèi)會(huì)發(fā)生代謝，炮制會(huì)影響阿魏酸與葡萄糖醛酸等結(jié)合反應(yīng)速度的變化，從而改變阿魏酸在體內(nèi)的半衰期及作用時(shí)間。
Part5結(jié)論
采用實(shí)驗(yàn)和理論相結(jié)合的方法，通過(guò)研究不同炮制方法對(duì)川芎中主要活性成分川芎嗪、阿魏酸的提取率以及形成機(jī)理的影響，結(jié)果表明不同的炮制方法對(duì)川芎中川芎嗪和阿魏酸的提取率具有顯著影響，這可能是由于它們的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞破壁與透皮吸收、體內(nèi)的生物利用度都發(fā)生變化的原因。以后可以進(jìn)一步探究炮制過(guò)程中的化學(xué)反應(yīng)細(xì)節(jié)，運(yùn)用更為先進(jìn)的分析手段（高分辨質(zhì)譜、多維色譜等）更加準(zhǔn)確地判定炮制過(guò)程中產(chǎn)生的一些微量物質(zhì)以及結(jié)構(gòu)變化。
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