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基因治療藥物（Gene Therapy Medicinal Products, GTMPs）的定義：GTMPs是一種包含遺傳物質的載體或遞送系統(tǒng)，旨在通過表達特定的基因來修復、調節(jié)、替換、添加或刪除遺傳序列。腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體因其理化性質穩(wěn)定、低免疫原性、致病性弱、整合風險低、目的基因表達持久等結構和生物學方面的優(yōu)勢，成為體內基因治療應用最廣泛的載體之一。目前已有至少6種AAV基因治療藥物獲EMA/FDA批準上市，包括Luxturna、Zolgensma、Glybera、Roctavian、Upstaza和Hemgenix。

眾所周知，非臨床研究數(shù)據(jù)對于支持臨床試驗的啟動和后續(xù)的藥品上市許可申請至關重要。非臨床研究中，選擇合適的動物種屬對于數(shù)據(jù)的臨床有效轉化也非常關鍵。本文討論下AAV基因治療產品選擇非臨床動物模型的關鍵考量因素。

AAV屬于細小病毒科，具有約4.7 kb的單鏈DNA基因組。目前已鑒定出13種AAV血清型，超過100種變體。通過替換AAV的Rep（復制）和Cap（衣殼）基因，可以將其改造為有效的基因治療載體。當然，AAV作為基因治療載體也有一定的風險，比如人體中普遍存在針對AAV的抗體，可能導致免疫原性問題。高達60%的人群在自然暴露后會產生抗AAV的中和抗體，這些抗體可以阻止AAV載體與細胞受體結合，從而降低基因治療的效果。而且，重復給藥可能導致更強烈的免疫反應，故AAV基因治療多為單次給藥。另外，AAV能趨向多種組織，可能導致轉基因在非靶組織表達，進而引發(fā)毒性。在非人靈長類動物和小型豬中，AAV給藥被發(fā)現(xiàn)可能導致背根神經節(jié)的毒性。高劑量AAV還可能導致嚴重的肝毒性、心肌炎等不良反應。近年來，研究人員通過多種策略解決這些問題，比較常見的是改造AAV的Cap基因，因為病毒衣殼對細胞/組織趨向性至關重要，同時也是先天和適應性免疫反應的識別位點。另外一種降低免疫反應的策略是改變給藥途經。眼睛、大腦、中樞神經系統(tǒng)、睪丸和子宮等部位被認為是免疫豁免區(qū)域，這些部位對AAV基因治療的免疫反應較弱。例如，Luxturna（AAV2基因治療）通過視網(wǎng)膜下注射給藥，臨床試驗中僅觀察到輕微的免疫反應，且未發(fā)現(xiàn)顯著的免疫原性。當然，非病毒載體技術的進步也是潛在解決AAV載體免疫原性、毒性、高成本的路徑之一，比如研究較多的脂質納米顆粒（LNPs）遞送。

一提到病毒，很多人比較擔心其傳染風險，甚至遺傳風險。AAV載體有復制缺陷，通過水平傳播（如人與人之間傳播）的可能性極低。盡管在人類精液樣本和小鼠睪丸中檢測到AAV載體，但未在生殖細胞中檢測到，且沒有通過生殖系傳遞給后代的證據(jù)。在臨床試驗中（如Glybera治療），也未觀察到生殖系遺傳的證據(jù)。另外，AAV載體在目標細胞核內以游離形式存在，整合率極低（0.1%-1%）。在FDA細胞、組織和基因治療咨詢委員會的會議上，討論了AAV載體的潛在安全性問題，特別是關于小鼠接受AAV治療后發(fā)展為肝細胞癌（HCC）的報告。目前，尚未在患者中觀察到與AAV載體相關的腫瘤發(fā)生事件。故，AAV載體的整體安全性其實并無太多擔憂。

AAV載體基因治療的臨床前/臨床轉化

AAV基因治療從基礎研究轉化為臨床試驗的過程中，選擇合適的動物種屬是關鍵，選擇動物種屬時可以從4個方面考慮：1）確認受試物在選定動物種屬中的藥理學活性；2）確認動物對AAV類型的易感性，即所選AAV可以感染該種屬；3）確認AAV的細胞/組織趨向性：確保AAV載體在動物中能夠靶向預期的細胞或組織；4）選擇的動物模型的生理特征應與人類相似，以更好地模擬臨床情況。如下圖所示。

藥理學活性比較容易理解，不只針對AAV基因治療，也適用于其它藥物形式的種屬選擇。需要確認目的基因在動物模型中的效力與人體相當。動物表達與人體相同的受體/表位/抗原。藥理學活性的確認可以通過體外或體內試驗方法確認。根據(jù)EMA指南（Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products），對于基因治療藥物（GTMPs）的新型AAV基因治療，非臨床安全性研究可以僅在一個動物種屬中開展。這點與傳統(tǒng)的化藥和生物藥的雙種屬要求不同。如果所選擇的動物模型不能充分反映臨床風險，則需要多個動物種屬交叉確認。不過，NMPA《腺相關病毒載體基因治療產品的非臨床研究技術指導原則》建議應獲得兩種相關動物種屬（嚙齒+非嚙齒）的非臨床安全性信息，若僅采用一種相關動物，需要提供科學合理的依據(jù)。已上市的6款AAV基因治療藥物重復給藥毒性試驗所用種屬分別為，Luxturna（犬、猴）、Zolgensma（小鼠）、Roctavian（小鼠、猴）、Upstaza（GLP大鼠，non-GLP猴）、HEMGENIX（小鼠、猴）、Glybera（小鼠）。

如果無藥理學相關動物模型，可以考慮采用在動物中有藥理學活性的替代分子開展研究，比如CD19-CAR T產品Yescarta和 Tecartus。除以上外，NMPA提醒在動物篩選及分組時需關注預存抗體及其對體內藥物暴露的可能影響，盡量選擇預存抗體陰性的動物用于試驗。

確認AAV載體在選定的動物種屬中是否可感染是相關動物種屬選擇的另一個關鍵因素。AAV載體必須能夠繞過宿主免疫系統(tǒng)，并在動物和人體中以類似的方式發(fā)揮作用。如果AAV載體在選定的非臨床動物種屬中不被接受，即不具備感染可能，也就不宜作為相關種屬開展后續(xù)研究。

除了感染敏感性，AAV載體是否對非臨床動物種屬和人體的細胞/組織具有趨向性，也是相關種屬選擇的重要依據(jù)之一。感染敏感性、細胞/組織趨向性可以通過查閱文獻初步確定，再通過體外和/或體內試驗進一步確證。常見AAV血清型不同種屬組織趨向性特點如下表所示。

嚙齒類動物是可以用于AAV基因治療的關鍵非臨床安全性研究的。不過，如果從小動物到人體的數(shù)據(jù)轉化存在挑戰(zhàn)，則可能需要使用大型動物模型（如小型豬、犬或非人靈長類動物）。比如，解剖學差異可能限制某些給藥途徑的操作實施。

另外，由于對背根神經節(jié)（DRG）毒性的擔憂，考慮到非人靈長類在AAV給藥后表現(xiàn)出與人類相似的DRG毒性，這類動物也可以考慮，且監(jiān)管機構認可。選擇的非臨床動物種屬與人類之間的生理差異也必須考慮，以確保動物生成的數(shù)據(jù)能夠準確轉化為人體。另外，通過廣泛的文獻分析發(fā)現(xiàn)，AAV基因治療產品最常用的種屬是小鼠，其次是大鼠，如下表所示（I.V. Intravenous, I.C. Intracardiac, I.Per. Intrapericardial, I.Cor. Intracoronary, I.M.Intramuscular, I.Vit. Intravitreal, Sub.Ret Subretinal, S.C. Subcutaneous.）。大小鼠常用的原因是繁殖速度快、易于飼養(yǎng)和操作，且能夠進行遺傳操作，產生新的轉基因品系。此外，現(xiàn)有的近交系特征明確，涵蓋免疫功能正常和免疫缺陷的品系，且有大量商業(yè)化試劑可用。近年來，人源化小鼠模型也被用于AAV基因治療藥物的開發(fā)。這些模型在目標基因在所選動物中不表達時具有優(yōu)勢，但使用這些模型也存在挑戰(zhàn)，比如模型復雜，難以按照GLP要求進行操作，且可能難以區(qū)分安全性和有效性問題。

在非臨床研究中，犬類（尤其是比格犬）曾是AAV基因治療最常用的非臨床研究大動物種屬，例如Luxturna。然而，近年來由于倫理問題，犬作為首選大型動物模型的地位受到質疑，小型豬的使用在逐漸增加。小型豬因其生理和解剖結構與人類相似，已成為標準的毒理學模型之一。其中，哥廷根小型豬（Göttingen Minipig）因其基因組特征明確、歷史背景數(shù)據(jù)豐富而備受關注，盡管這些歷史數(shù)據(jù)主要來自小分子藥物研究。哥廷根小型豬在AAV基因治療研究中也得到了廣泛應用，例如用于靶向肝臟的AAV研究、針對亨廷頓病的AAV-miHTT基因治療，以及FDA批準的AAV基因治療藥物Zolgensma的非臨床研究。

非人靈長類動物因其與人類在進化關系、生理和藥理學方面高度相似，也是AAV基因治療藥物非臨床研究的選擇之一。然而，由于倫理問題，使用非人靈長類動物的前提是，受試物在其他毒理學常用種屬中無藥理活性。非人靈長類動物被用于Luxturna和Zolgensma等藥物的非臨床研究。

以上基本是從AAV，也就是病毒載體的角度，思考如何選擇合適的種屬。除此以外，AAV攜帶的目的基因也要納入考量。這點，NMPA在其指導原則里面有清晰描述，動物相關種屬選擇需考慮動物對AAV載體攜帶的目的基因的轉錄和/或表達可行性及其表達產物的生物學效應與預期的人體效應的相似性。這點比較常規(guī)，不再展開，可以借鑒生物藥的一些思路。