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1. 引言

色譜技術(shù)的靈魂在于分離，而分離度則是衡量分離效果的“尺子”。這把“尺子”如何制作，直接關(guān)系到測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性與公正性。在色譜分析中，我們通常使用分離度來(lái)評(píng)價(jià)兩個(gè)相鄰色譜峰的分離程度。然而，一個(gè)常被忽略的關(guān)鍵問(wèn)題是：計(jì)算分離度時(shí)所使用的“峰寬”應(yīng)如何定義？是使用由拐點(diǎn)切線(xiàn)確定的基線(xiàn)峰寬（W），還是使用峰高一半處的半高峰寬（Wh/2）？這兩種選擇背后，蘊(yùn)含著對(duì)色譜數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性與公正性的深刻考量。

圖1 峰寬與半高峰寬計(jì)算的典型示意圖（來(lái)源：ChP2025）

2. 理論基礎(chǔ)與計(jì)算方法

2.1 關(guān)于分離度

分離度的通用定義為兩個(gè)相鄰組分的保留時(shí)間之差與兩峰平均寬度的比值。其物理意義在于衡量?jī)蓚€(gè)色譜峰在流出色譜柱后，是否在檢測(cè)器處實(shí)現(xiàn)了足夠的空間或時(shí)間上的分離，以避免定量分析時(shí)的相互干擾。

2.2 基于基線(xiàn)峰寬的計(jì)算方法

這是最經(jīng)典、最直觀(guān)的計(jì)算方法。其公式為：

其中，tR1 和 tR2 為保留時(shí)間，W1 和 W2 為兩峰在基線(xiàn)上的寬度。該寬度是通過(guò)在色譜峰的兩側(cè)拐點(diǎn)處作切線(xiàn)，使其與基線(xiàn)相交后測(cè)得的距離。 

優(yōu)勢(shì)與局限：該方法直接反映了兩個(gè)峰在基線(xiàn)處的重疊程度，理論意義明確。然而，對(duì)于非理想峰形，如嚴(yán)重拖尾或前沿峰，準(zhǔn)確確定拐點(diǎn)位置并作出重現(xiàn)性高的切線(xiàn)則十分困難，導(dǎo)致測(cè)量值主觀(guān)性強(qiáng)，穩(wěn)定性差（當(dāng)然，這只是相對(duì)來(lái)說(shuō)的）。

2.3 基于半高峰寬的計(jì)算方法

該方法近年來(lái)被各國(guó)藥典逐步采納，在新版中國(guó)藥典中也明確指定該方法為異議裁判方法，其公式為：

其中，Wh/2,1、Wh/2,2分別為此相鄰兩色譜峰的半高峰寬。

公式推導(dǎo)：此公式是基于一個(gè)重要的假設(shè)——色譜峰為理想的高斯峰。對(duì)于一個(gè)理想高斯峰，其基線(xiàn)峰寬與半高峰寬存在固定的數(shù)學(xué)關(guān)系：W=1.699×Wh/2。將此關(guān)系代入基線(xiàn)峰寬的計(jì)算公式：

Rs=2ΔtR/(1.699Wh/2,1+1.699Wh/2,2)=(2/1.699)×(ΔtR/(Wh/2,1+Wh/2,2))≈1.18ΔtR/(Wh/2,1+Wh/2,2)

因此，系數(shù) 1.18 是基于理想高斯峰推導(dǎo)的結(jié)果。

3.兩種方法的對(duì)比分析

為了直觀(guān)展示差異，我們模擬兩種常見(jiàn)情景。

3.1 理想峰形的對(duì)比

當(dāng)兩個(gè)色譜峰均為對(duì)稱(chēng)的理想高斯峰時(shí)，根據(jù)上述理論關(guān)系，兩種計(jì)算方法得出的結(jié)果在數(shù)學(xué)上應(yīng)是一致的。例如，對(duì)于tR1=4.0min，tR2=4.4 min，Wh/2，1=Wh/2，2=0.2min的峰，無(wú)論用哪種公式，計(jì)算出的分離度均為1.18。此時(shí)，兩種方法無(wú)優(yōu)劣之分。

3.2非理想峰形（拖尾峰）的對(duì)比

假設(shè)峰1為嚴(yán)重拖尾峰（拖尾因子=2.5）（峰拖尾問(wèn)題的原因與解決：HPLC峰拖尾問(wèn)題分析及解決思路），峰2為對(duì)稱(chēng)峰。在此情況下：

·半高峰寬的測(cè)量位于峰的上半部分，受拖尾部分影響較小，因此 Wh/2值保持穩(wěn)定（理想情況，事實(shí)上隨著峰拖尾的加劇半高峰寬也會(huì)隨著發(fā)生微小變化），計(jì)算出的分離度仍為1.18。（圖1A）

·基線(xiàn)峰寬則會(huì)因拖尾而被嚴(yán)重拉寬。假設(shè)W1從理想的0.34min增至0.48 min。此時(shí)分離度計(jì)算值則為：

Rs=2×0.4/(0.48+0.34) =0.98（圖1B）

圖1A.理想對(duì)稱(chēng)峰的基線(xiàn)峰寬(W)測(cè)量明確；圖1B.拖尾峰的基線(xiàn)峰寬因拖尾部分而顯著增大，測(cè)量重現(xiàn)性差

3.3實(shí)例中的表現(xiàn)

以一個(gè)典型的小峰拖尾，后接一拖尾大峰的情形為例：

圖2.實(shí)例示意圖

積分參數(shù)不變，僅改變計(jì)算方式，該峰以傳統(tǒng)的基線(xiàn)峰寬計(jì)算分離度為1.25，以半高峰寬計(jì)算分離度為1.29，當(dāng)調(diào)整積分參數(shù)，將主峰積分截止時(shí)間適當(dāng)提前0.5min后，以基線(xiàn)峰寬計(jì)算分離度為1.28，以半高峰寬計(jì)算則分離度仍為1.29。

以該實(shí)例來(lái)看影響并沒(méi)有那么大，實(shí)際經(jīng)過(guò)多番嘗試，多種情形下，兩種積分方式差異普遍在0.0x這個(gè)水平，以半高峰寬計(jì)算時(shí)，積分參數(shù)改變也多有變化的情況。并且實(shí)際觀(guān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，并沒(méi)有哪種方式更加嚴(yán)格哪種方式分離度更低/高的結(jié)論，觀(guān)測(cè)結(jié)果也表明，以半高峰寬計(jì)算時(shí)，在積分參數(shù)微小變化時(shí)，總的來(lái)說(shuō)分離度更加穩(wěn)健一些。

3.4 《中國(guó)藥典》2025版修訂的原因剖析

上述案例揭示了藥典委員會(huì)轉(zhuǎn)向半高峰寬的根本原因：

·穩(wěn)健可靠：半高峰寬的測(cè)量點(diǎn)明確，受基線(xiàn)噪聲、峰尾重疊和積分算法參數(shù)的影響遠(yuǎn)小于基線(xiàn)峰寬。這在多實(shí)驗(yàn)室協(xié)作或數(shù)據(jù)復(fù)核時(shí)，能提供更高的結(jié)果穩(wěn)定性和一致性

·仲裁方法：基線(xiàn)峰寬在應(yīng)對(duì)非理想峰形時(shí)，其測(cè)量易產(chǎn)生爭(zhēng)議。以半高峰寬為準(zhǔn)，一定程度上消除了積分主觀(guān)性所帶來(lái)的仲裁困難，使裁決結(jié)果更加客觀(guān)、公正。

·國(guó)際接軌：與USP、EP等國(guó)際主流藥典保持了一致，有利于促進(jìn)國(guó)際藥品評(píng)審與監(jiān)管的互認(rèn)。

4. 結(jié)論

綜上所述，基于基線(xiàn)峰寬和半高峰寬的分離度計(jì)算方法，在理論上是相通的，但在實(shí)際應(yīng)用中隨著峰形的變化，存在一定差異?；€(xiàn)峰寬法雖直觀(guān)，但其測(cè)量在特殊場(chǎng)景下重現(xiàn)性不佳，易引發(fā)爭(zhēng)議，盡管兩種方式絕大多數(shù)情況下差異并不大，但是半高峰寬法的引入為異議裁決提供了方案。《中國(guó)藥典》2025年版的修訂，并非簡(jiǎn)單的新增公式，而是一次基于科學(xué)實(shí)踐、旨在提升數(shù)據(jù)質(zhì)量與監(jiān)管效力的重要進(jìn)步。