前言
如果您還沒有建立 HPLC 方法，要進(jìn)行穩(wěn)定而重復(fù)的分析，就需要進(jìn)行方法開發(fā)了。具備進(jìn)行成功方法開發(fā)的技能，對解決將來可能遇到的復(fù)雜分析極有幫助。
優(yōu)化反相色譜條件
在確定了色譜柱規(guī)格、合適的固定相柱填料、流動相溶劑和改性劑后，即可開始優(yōu)化方法。方法的優(yōu)化是根據(jù)最終目標(biāo)決定的。如果要開發(fā)質(zhì)量控制方法，您可能會需要像等度分離這種可變因素較少的方法。如果目標(biāo)是得到最高分離度，節(jié)省分析時間并不是首要問題，可以選擇長柱使所有組分都得到最大分離度。如果分離速度很重要，則應(yīng)使用短柱和高流速。對于含許多保留不同的目標(biāo)化合物的復(fù)雜樣品，用等度分離可能不能解決問題，應(yīng)開發(fā)并優(yōu)化梯度方法。
我們按約定俗成將水相溶劑和反相色譜中較弱的溶劑稱為流動相“A”，“B”溶劑是有相組成較高和較強(qiáng)的溶劑。在反相色譜模式中，當(dāng)增加 B 的百分比時，通常保留將減少。請注意，在還沒有開發(fā)出樣品的實際分析方法前，大部分人開發(fā) HPLC 方法都是采用“反復(fù)實驗”的方法，即，嘗試各種不同流動相條件，以找出最佳條件。
等度（流動相組成不變）
等度優(yōu)化的一般方法是不斷改變流動相強(qiáng)度（%B），直到獲得適當(dāng)?shù)谋Ａ舴秶?。這種方法有時也稱為“溶劑篩查”。對于簡單的分離，k 值應(yīng)在 1 到 10 之間。如果 k 值太低（比如，< 1），早洗脫的色譜峰可能不發(fā)生保留峰或融入基質(zhì)組分，因此對其進(jìn)行定量將非常困難而且不可重復(fù)。另外，低 k 值峰受柱外效應(yīng)影響很大，可能會使峰展寬。如果 k 值太大（比如，> 10），分析時間將變得過長，檢測限會因峰展寬而提高。
對于反相色譜中的等度方法開發(fā)是從流動相有機(jī)改性劑最高比例開始，然后逐漸降低。在降低流動相強(qiáng)度之前，先要確定所有組分都已從柱中洗出。如果組分保留在色譜柱中，以后可能在 B 相比例較低的流動相中洗脫，成為無法解釋的“鬼峰”。通常，流動相以 +/-10%（如，90% B、80% B、70% B 等）或 +/-20% 的幅度改變。利用一些現(xiàn)代軟件（如，ChromSword 的 ChromSword，ACD 的 AutoChrom），顯示保留變化曲線，系統(tǒng)進(jìn)行自動調(diào)節(jié)，更快得到優(yōu)化條件。當(dāng)接近最佳等度條件時，進(jìn)行手動調(diào)節(jié)，幅度應(yīng)減為 5% 或 3%。
請注意，如果流動相“A”中含高濃度緩沖液（比如，大于 25 mM），則不能使用 100% 的 B，因為當(dāng)兩種溶劑系統(tǒng)開始混合，隨著 B 相百分比的減少，可能發(fā)生沉淀。一旦建立優(yōu)化條件，如果目標(biāo)還沒有得到完全分離，則需繼續(xù)提高選擇性 (α)。如需分離兩個相鄰的色譜峰會涉及到許多實驗參數(shù)的調(diào)節(jié)。溫度可以作為一個變量。大多數(shù)現(xiàn)代儀器都具有某種類型的柱溫控制器，大部分反相柱可以承受高達(dá) 60 ℃ 的溫度，有些甚至更高。一般來說，升高溫度可以縮短所有峰的保留時間，但對有些峰的影響可能與對其它峰不同，從而導(dǎo)致選擇性發(fā)生變化。
其它用于改變選擇性的變量如下：
1. pH（對于可離子化的化合物）
2. 緩沖液（離子）強(qiáng)度
3. 緩沖液類型（比如，磷酸鹽、醋酸鹽或甲酸鹽，取決于需要的 pH 范圍）
4. 流動相有機(jī)改性劑（比如，從乙腈變?yōu)榧状蓟騼烧叩幕旌弦?；可使用三元和四元流動相混合溶劑?/span>
5. 流速（一般而言，由于提高了柱效，較低的流速可能對分離略有改善，但也有例外——見下面的提示）
6. 離子對試劑濃度（如果使用離子對 RPC）
如果調(diào)節(jié)這些參數(shù)還不能改善分離，那么最好的解決辦法就是改變色譜柱或固定相。更長的色譜柱具有更多塔板數(shù)，因此有助于分離，但切記，分離度只能增加長度的平方根。柱長加倍使分析時間和溶劑消耗加倍，而靈敏度降低，但只能使分離度提高約 40%。改用較小粒度色譜柱也能增加塔板數(shù)，但柱壓上升 。使用新的固定相（如 C18 換成苯基柱）需要進(jìn)行一套新的溶劑篩選實驗，耗費(fèi)更多時間，但可能得到最佳的分離結(jié)果。但需要額外購買具有不同固定相的反相柱。
梯度（流動相強(qiáng)度隨時間變化）
對于含各種組分的樣品混合物來說，選擇單一流動相組分可能得不到滿意的解決方案（比如，一般洗脫問題）。例如，某些樣品組分，如強(qiáng)極性分析物，可能很快從反相柱上被洗脫下來，而疏水性組分可能在疏水性的 C8 或 C18 上吸附非常強(qiáng)，洗脫不下來。對這一問題的解決方案是隨時間改變流動相組成（梯度洗脫）。在絕大多數(shù)例子中，初始流動相非常弱（比如，含水量高），隨時間的推移，有機(jī)溶劑的百分比通常是以線性形式增加
兩種情況下要使用梯度洗脫的方法開發(fā)過程。一種是用梯度預(yù)測反相分離的最佳起始等度條件。大多數(shù)方法開發(fā)軟件（如，DryLab、ChromSword、AutoChrom）都具有這項功能，最少進(jìn)行兩次梯度分離，然后預(yù)測出最佳等度條件。接下來就可以用這些條件進(jìn)一步進(jìn)行等度分離優(yōu)化了。
第二種情況是開發(fā)梯度方法，并使用了寬范圍的快速梯度（比如，10 分鐘內(nèi) B 由 5% 變到 95%），確定目標(biāo)化合物的最佳梯度范圍。實際上，某些軟件系統(tǒng)可以通過色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)/控制器之間的相互作用來設(shè)置最佳梯度，對分離進(jìn)行優(yōu)化。但是，手動操作也可以完成同樣的工作，找到目標(biāo)峰洗脫的流動相比例，然后通過下一次梯度，調(diào)節(jié) k*（梯度等于 k）范圍，讓梯度分離在合理的時間內(nèi)完成。
然后，與等度優(yōu)化一樣，當(dāng)分離時間合理后進(jìn)行選擇性的確定。
幾種常規(guī)的梯度設(shè)置
HILIC色譜柱
親水相互作用液相色譜 (HILIC) – 有時也被稱為“水相正相”(ANP) – 是一項已發(fā)展了數(shù)十年的技術(shù)。由于這項技術(shù)能夠?qū)Ψ聪嘀喜槐Ａ艋虮Ａ糨^差的極性化合物進(jìn)行分析，近年來又重新受到了重視。而且，這項技術(shù)很容易與 MS 和 MS-MS 檢測技術(shù)兼容。當(dāng) HILIC 分離使用高有機(jī)相流動相時，與水相緩沖系統(tǒng)相比由于具有較低的離子抑制，從而提高了 MS 靈敏度。
HILIC 使用極性固定相，如硅膠、氨基、混合模式、兩性離子等，以及水溶性的、非極性流動相，由少量水（至少 2.5% 體積比）和高比例有機(jī)相組成。
在 HILIC 方法中，親水、極性和帶電荷化合物比疏水、中性化合物更容易保留。與反相液相色譜完全相反。
在流動相中加水會降低保留。HILIC 與正相色譜相比，能得到強(qiáng)極性溶質(zhì)的良好峰形。是反相色譜的補(bǔ)充方法，由于保留了親水性化合物，因此常使洗脫順序倒置。
正相色譜
正相或吸附色譜的出現(xiàn)早于反相色譜。“正”的叫法源自其原本概念，即，固定相為極性、流動相為非極性、極性化合物保留更強(qiáng)。
在正相色譜中，使用硅膠或另一種極性固定相，如短鏈氨基或二醇。流動相為非極性——通常為烴類、二氯甲烷、乙酸乙酯，或另一種水溶性的溶劑。在正相色譜中，極性組分保留更強(qiáng)。隨流動相極性增大極性組分保留減弱。使用的流動相極性越強(qiáng)，分析物的洗脫越快。在硅膠柱上進(jìn)行正相梯度分離時，可以從己烷等非極性溶劑開始，然后逐漸加入極性溶劑，如乙酸乙酯，比如，乙酸乙酯從 5% 到 95%。根據(jù)目標(biāo)物的洗脫位置，可以調(diào)節(jié)梯度以改善所有組分的分離。有時加入一定量的水或少量異丙醇，可以調(diào)節(jié)硅膠填料的表面活性。鍵合相色譜柱可能不需要水的存在，并常使用醇類作為改性劑。
我們使用正相色譜的原因之一是使更多的極性化合物得到保留。也可以用這種模式洗脫在反相色譜中高度保留的疏水化合物。
正相色譜有許多用途。適合分離幾何異構(gòu)體和位置異構(gòu)體。可得到比反相色譜更高的分辨率。當(dāng)我們沒有水溶性的溶劑時，可以使用正相色譜。也可以用于制備分離，流動相不含水，易于蒸發(fā)。
總結(jié)：正相
• 柱填料為極性：硅膠（最強(qiáng)）>氨基>二醇>氰基（最弱）
• 流動相為非極性：己烷、異辛烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等
• 極性化合物保留更強(qiáng)
• 隨流動相極性增大保留減弱
選擇正相的目的：
• 分離高度保留的疏水樣品
• 分離異構(gòu)體
• 樣品進(jìn)樣溶劑為非極性和/或非水溶性的
• 使用非極性溶劑進(jìn)行回收
離子交換色譜
離子交換色譜可以分離離子型化合物和可離子化的化合物。在這種模式中，我們使用帶有離子型官能團(tuán)的填料，其所帶電荷與分析物相反。在強(qiáng)陽離子交換 (SCX) 色譜中，我們要分析帶正電荷的分子或陽離子，因此使用的是陰離子型或帶負(fù)電荷的固定相。如果我們要分析帶負(fù)電荷的分子或陰離子，應(yīng)使用陽離子型或帶正電荷的固定相。
在離子交換色譜中，流動相通常含水量較高，并含有緩沖液或鹽。通過連續(xù)或階梯梯度增加離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行洗脫。常用于對生物大分子的分離，也用于小分子的分離，如氨基酸、無機(jī)陽離子和陰離子，以及氨類或羧酸等可離子化的化合物。
離子交換色譜小結(jié)：
• 柱填料含離子基團(tuán)（如，磺酸鹽、四烷基銨）
• 流動相為水相緩沖液（如，磷酸鹽、甲酸鹽、TRIS 等）
• 比反相色譜用得少
• 與離子對色譜相似（更多信息請參見詞匯表）
凝膠滲透色譜/體積排阻色譜
在 GPC/SEC 中，樣品分子與填料之間不存在相互作用，并通過擴(kuò)散進(jìn)入多孔聚合物基質(zhì)或硅膠基質(zhì)的孔隙中。根據(jù)分子的體積大小和相應(yīng)填料孔隙大小進(jìn)行分離。體積比填料孔隙大的分子不能擴(kuò)散進(jìn)入填料，而體積比填料孔隙小的分子則可以進(jìn)入填料，因此樣品得到分離。與反相色譜不同的是，大分子先洗脫出來，小分子后洗脫出來。
通常，較大分子被排阻在孔隙之外，從而快速從色譜柱中洗脫出來，為完全排阻體積。最小的分子可以滲透入色譜柱的所有孔隙，最后洗脫出來，為完全滲透體積。其它所有分子在這兩者之間按分子大小洗脫出來。如果要測定單個組分的分子量 (MW) 或整體分布，需要先用已知分子量的標(biāo)樣以洗脫體積對 log MW 建立校正曲線。然后，在與標(biāo)樣相同的條件下分析聚合物樣品，即可測定該聚合物的分子量和分子量分布。
主要選用流動相溶解分析物。
GPC/SEC 小結(jié)：
• 兩種模式：非水相 GPC 和水相 SEC（也稱凝膠過濾色譜，或 GFC）
• 在體積排阻色譜中，樣品分子與填料之間無相互作用，并通過擴(kuò)散進(jìn)入多孔聚合物基質(zhì)的孔隙中。根據(jù)分子的體積大小和相應(yīng)填料孔隙大小進(jìn)行分離。在不同溶劑或流動相中可能得到不同的流體動力學(xué)半徑。
• 主要選用流動相溶解分析物
• 主要用于聚合物表征、聚合物分子量測定和蛋白質(zhì)分離
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