液相色譜（LC）作為現(xiàn)代分析化學(xué)的基石，其檢測器的性能直接決定了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、靈敏度和可靠性。在眾多檢測器中，可變波長光度檢測器（VWPD，190~800nm）因其靈活性和廣泛的適用性而備受青睞。然而，如何客觀、標(biāo)準(zhǔn)地評價一臺VWPD的性能，是所有實驗室都必須面對的問題。美國材料與試驗協(xié)會（ASTM）發(fā)布的E1657-98標(biāo)準(zhǔn)和我國的GB/T 32211-2015為此提供了一套全面而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮饕?guī)程。本文旨在系統(tǒng)介紹其涵蓋的核心性能指標(biāo)、測試方法和重要意義，為實際操作提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。
1. 具體檢測項目及其概念解釋
1.1 噪音（Noise）與漂移（Drift）——檢測器穩(wěn)定性的基石
①短期噪音（Short-term noise）：指頻率大于每分鐘一次的所有隨機信號變化的最大峰-峰值振幅。它是決定檢測器最低檢測能力和痕量分析精密度的關(guān)鍵因素。短期噪音越小，檢測器捕捉微弱信號的能力就越強。
②長期噪音（Long-term noise）：指頻率在每小時6到 60 次之間的隨機信號變化的最大振幅。這種低頻噪音在長時間的色譜分析中尤其致命，因為它可能被誤判為晚流出的色譜峰，從而導(dǎo)致定性或定量錯誤。
③漂移（Drift）：指檢測器基線在一個小時內(nèi)的平均變化斜率，單位是吸光度單位/小時（AU/h）。漂移反映了檢測器基線的長期穩(wěn)定性，過大的漂移會影響長時間分析的準(zhǔn)確性，尤其是在進行梯度洗脫或長時間等度分析時。
1.2 線性范圍（Linear Range）——定量分析的可靠區(qū)間
線性范圍是指在此濃度區(qū)間內(nèi)，檢測器響應(yīng)與樣品濃度的比率保持恒定（偏差在 5% 以內(nèi)）。它定義了檢測器能夠進行準(zhǔn)確定量的濃度范圍。一個寬廣的線性范圍意味著檢測器能夠同時準(zhǔn)確分析高濃度和低濃度的樣品，這對于方法開發(fā)和樣品普適性至關(guān)重要。
1.3. 靜態(tài)（static）：在無流量下的狀態(tài)。
1.4 動態(tài)（dynamic）：在流量為1.0ml/min下的狀態(tài)。
1.5 最小檢測限（Minimum Detectability）——靈敏度的極限
標(biāo)準(zhǔn)將其定義為：能產(chǎn)生兩倍于靜態(tài)短期噪音信號的特定溶質(zhì)濃度。這個指標(biāo)直接反映了檢測器的靈敏度極限。需要注意的是，標(biāo)準(zhǔn)采用的“兩倍峰-峰值噪音”是一個相對保守的定義，相比于統(tǒng)計學(xué)上常用的“三倍均方根噪音”，它對檢測器的要求更為嚴(yán)格。
1.6 波長準(zhǔn)確度（Wavelength Accuracy）與精密度（Wavelength Precision）——光譜選擇性的保證
①波長準(zhǔn)確度：指觀測到的波長最大值與已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)吸收峰最大值的偏差。波長設(shè)置不準(zhǔn)，會直接影響檢測的靈敏度和線性范圍，甚至可能導(dǎo)致目標(biāo)物漏檢。
②波長精密度：衡量操作者在反復(fù)重設(shè)波長后，檢測器返回到同一光譜位置的能力。它通過重復(fù)測量標(biāo)準(zhǔn)品在最大吸收波長處的吸光度值的再現(xiàn)性來評估。高精密度確保了不同批次、不同時間實驗結(jié)果的一致性。
1.7 吸光度校準(zhǔn)（absorbance calibration）：校正吸光度范圍在±5%以內(nèi)的驗證程序。
1.8 響應(yīng)時間（Response Time）——捕捉快速變化的能力
響應(yīng)時間定義為當(dāng)流動相組成發(fā)生階躍變化時，檢測器輸出從新平衡值的 10%變化到90% 所需的時間。雖然對于大多數(shù)常規(guī)色譜分析而言，檢測器的響應(yīng)時間足夠快，但在超高效液相色譜（UHPLC）等產(chǎn)生窄峰的應(yīng)用中，過慢的響應(yīng)時間可能會導(dǎo)致峰形展寬和分離度下降。
2. 測試方法
2.1. 噪音與漂移的測量
這是評估檢測器基礎(chǔ)性能最核心的測試，分為靜態(tài)和動態(tài)兩種模式。
2.1.1準(zhǔn)備工作：
溶劑：使用純凈、經(jīng)過濾和脫氣的甲醇作為流動相。
預(yù)熱：檢測器必須在測試現(xiàn)場開啟并預(yù)熱至少24h小時，以消除預(yù)熱不足帶來的額外漂移。
系統(tǒng)設(shè)置：波長設(shè)置為 254 nm。系統(tǒng)需連接背壓裝置（提供背壓≥75kPa）和細(xì)管路以防止氣泡產(chǎn)生。
測定前準(zhǔn)備：用甲醇反復(fù)沖洗色譜系統(tǒng)，取出系統(tǒng)中的其他溶劑。用泵帶動甲醇沖洗整個系統(tǒng)至少30min。
2.1.2靜態(tài)測試（Static Test, 無流動相）：
停止泵的流動，讓系統(tǒng)在室溫下穩(wěn)定至少1小時。
設(shè)置檢測器為最高靈敏度（最小衰減量），記錄至少1小時的基線信號（環(huán)境溫度變化不超過2℃）。
通過標(biāo)準(zhǔn)推薦的作圖法（如圖2所示），在記錄的基線上繪制包絡(luò)線，精確計算出靜態(tài)短期噪音、長期噪音和漂移值。這種作圖法直觀且標(biāo)準(zhǔn)化，有效避免了主觀判讀帶來的誤差。
2.1.3動態(tài)測試（Dynamic Test, 流速 1.0 mL/min）：
以1.0 mL/min 的流速輸送甲醇，穩(wěn)定15分鐘后開始記錄。
同樣記錄至少1小時的基線信號。
采用與靜態(tài)測試完全相同的方法，計算出動態(tài)短期噪音、長期噪音和漂移（環(huán)境溫度變化不超過2℃）。
通過對比靜態(tài)和動態(tài)測試的結(jié)果，可以判斷泵的脈動、溶劑混合不均等流動相因素對檢測器性能的影響。
備注：
①畫幾組長度在0.5min~1min之間的平行包絡(luò)線，觀測任意15min周期內(nèi)所有檢測的隨機變化的框圖（見圖2）。基礎(chǔ)出所有部分的平均值，以AU表示的距離除以光程（cm）得到短期噪聲。
②在15min靜態(tài)短期噪聲測量段的中間做標(biāo)記，在中間部分的四周畫一系列平行包絡(luò)線組，每組對應(yīng)10min長，選擇線間縱向距離最大的一組平行包絡(luò)線（見圖2）。將縱向距離AU值除以光程（cm）得到長期噪聲。
③畫一組1h縱向距離最小的平行包絡(luò)線（見圖2），每根線的斜率為漂移（用AU/h表示）。
2.2.波長準(zhǔn)確度與精密度的測量
該測試是確保色譜方法可靠性和重現(xiàn)性的關(guān)鍵。
2.2.1波長準(zhǔn)確度測試流程：
①選擇標(biāo)準(zhǔn)品：推薦使用具有明確已知吸收峰的高氯酸鉺溶液（將2g的六水合高氯酸鉺溶解到25ml的水中，過濾即得）。其他備選物質(zhì)包括高氯酸鈥或萘。
②逐點掃描：在標(biāo)準(zhǔn)品已知吸收峰附近（如高氯酸鉺的255nm峰，掃描范圍可設(shè)為250-260 nm），以0.5至1.0nm的微小增量，逐點測量吸光度。每改變一次波長，都需要用溶劑（若為高氯酸鉺溶液，溶劑為水）重新歸零，再注入標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)，以確保測量的準(zhǔn)確性。
③數(shù)據(jù)分析：將測得的“吸光度-波長”數(shù)據(jù)繪制成圖（如圖3所示），從圖中確定吸收峰的最大值。
④結(jié)果評估：將測量得到的最大吸收波長與已知值（如 255 nm）進行比較。如果偏差超出了制造商規(guī)定的規(guī)格，則表明檢測器的光學(xué)系統(tǒng)（如燈源或單色器）可能需要校準(zhǔn)或維修。
2.2.2波長重復(fù)性測試流程：
該測試相對簡單，操作者只需多次將檢測器波長設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長，然后重復(fù)測量其吸光度。通過計算吸光度讀數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），即可評估波長重設(shè)的精密度。
2.3.最小檢測限、線性范圍和校準(zhǔn)
2.3.1 最小檢測限
簡單來說，最小檢測限就是這臺儀器能“看”到的最小信號量，也就是它能檢測到的最低濃度是多少。通過測量儀器在沒有樣品時自身產(chǎn)生的“背景噪音”大小，來確定它能識別出的最小有效信號。
測試流程：
①讓純的流動相（比如甲醇）持續(xù)流過檢測器，模擬一個干凈的背景環(huán)境。
②記錄下此時儀器輸出信號的波動，也就是“靜態(tài)短期噪聲”。
③最小檢測限就是這個靜態(tài)短期噪聲值的 2 倍。
2.3.2線性范圍
線性范圍指的是在此濃度區(qū)間內(nèi)，樣品的濃度和儀器檢測到的信號強度成正比關(guān)系。濃度越高，信號就越強，而且是均勻、可預(yù)測地增強。通過測試一系列從低到高不同濃度的樣品，畫出一條“濃度-信號”關(guān)系曲線，看這條曲線在哪一段是筆直的直線。
測試流程：
準(zhǔn)備樣品：用甲醇作為溶劑，配制一系列濃度逐漸增加的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。樣品要有一個特點：在某個特定波長下有強烈的紫外吸收。
從低到高測試：
①先用純甲醇把儀器讀數(shù)調(diào)到零點。
②然后按照從最低濃度到最高濃度的順序，依次將樣品注入檢測器，并記錄下每個濃度對應(yīng)的信號值（吸光度值）。
③判斷線性：將得到的數(shù)據(jù)點繪制成圖。理想情況下，這些點應(yīng)該能連成一條直線。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，只要數(shù)據(jù)點與這條理想直線的偏差在±5% 以內(nèi)，就認(rèn)為它處于線性范圍之內(nèi)。
④確定范圍：這條直線的起點（最小線性濃度）和終點（最高線性濃度）之間的區(qū)域，就是該檢測器的線性范圍。
2.3.3. 吸光度校準(zhǔn)
吸光度校準(zhǔn)是為了確保儀器測量出的吸光度值是準(zhǔn)確的，也就是對儀器的讀數(shù)進行“對表”。
使用一種已知在特定波長下有精確吸光值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，來檢查儀器的測量結(jié)果是否與之相符。
測試流程：
①準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)溶液：配制特定濃度的六水合高氯酸鉺溶液。這種物質(zhì)的特性是，在特定波長下，它的吸光度值是已知的、穩(wěn)定的。
②波長掃描：
先用純水沖洗檢測池，記錄一個空白讀數(shù)。
然后用高氯酸鉺溶液沖洗并充滿檢測池。
以1 nm為步長，在特定波長范圍（如250 nm到260 nm）內(nèi)掃描，記錄每個波長的吸光度值。
③繪制曲線并比較：
將掃描得到的數(shù)據(jù)繪制成“吸光度-波長”曲線圖。
從圖上找出最大吸收波長對應(yīng)的吸光度值。
將這個測量值與已知的標(biāo)準(zhǔn)值進行比較。
④判斷準(zhǔn)確性：如果測量值與標(biāo)準(zhǔn)值的誤差在±5% 以內(nèi)，就認(rèn)為這次校準(zhǔn)是合格的，證明儀器讀數(shù)準(zhǔn)確。
2.4 響應(yīng)時間的測試
簡單來說，響應(yīng)時間就是檢測器反應(yīng)有多快。當(dāng)有樣品流過檢測器時，信號會從一個穩(wěn)定的低值（基線）迅速上升到一個穩(wěn)定的高值。響應(yīng)時間衡量的就是這個信號“爬坡”過程的速度，具體是指信號從最終穩(wěn)定值的10%爬升到90%所需要的時間。
響應(yīng)快（時間短）：儀器能捕捉到那些一閃而過的、很窄的色譜峰，分析結(jié)果更準(zhǔn)確。
響應(yīng)慢（時間長）：如果色譜峰很窄，儀器還沒來得及反應(yīng)，峰就已經(jīng)過去了，會導(dǎo)致測量到的峰變寬、變矮，甚至完全看不見，影響定量和定性分析的準(zhǔn)確性。
2.4.1 響應(yīng)時間的測試步驟
通過一個閥門，瞬間將一股有吸收的液體（模擬樣品）切換進檢測器，同時用記錄儀畫出信號變化的曲線，然后從曲線上量出時間。
①準(zhǔn)備裝置：在泵和檢測器之間，安裝一個1 mL 的定量環(huán)進樣閥。這個閥門的作用就像一個開關(guān)，可以瞬間改變流進檢測器的液體。
②設(shè)定流速：將泵的流速設(shè)置為2.0 mL/min。
③開始測試：
首先，讓純?nèi)軇ū热缂状迹┝鬟^整個系統(tǒng)，這時記錄儀上會畫出一條平直的低位基線，代表“初始平衡”狀態(tài)。
然后，瞬間切換進樣閥，讓一股能產(chǎn)生吸收信號的溶液（比如含有一定濃度樣品的甲醇）進入檢測器。
此時，記錄儀上的信號會迅速上升，并最終達(dá)到一個新的、平直的高位基線，代表“新平衡”狀態(tài)。
④讀取數(shù)據(jù)：
在記錄下來的信號曲線上（如下圖所示），找到信號從開始變化到最終穩(wěn)定的那段“爬坡”曲線。
確定初始平衡線和新平衡線的位置，并計算出它們之間信號差值的10%和90%對應(yīng)的位置。
測量并記錄從10%位置到90%位置所花費的時間，這個時間就是響應(yīng)時間。
重復(fù)驗證：為了結(jié)果的可靠性，標(biāo)準(zhǔn)還提到可以改變流速（如增加到3.0 mL/min）或者在最大和最小量程下重復(fù)進行測試，以確保在不同條件下都能獲得準(zhǔn)確的測量結(jié)果。
3. 結(jié)論與實踐意義
遵循此標(biāo)準(zhǔn)可以確保新購儀器的性能符合預(yù)期，并為儀器的全生命周期管理提供基準(zhǔn)數(shù)據(jù)。對于一線分析人員而言，理解并應(yīng)用這些測試方法，能夠幫助他們更好地了解自己所用儀器的性能邊界，及時發(fā)現(xiàn)潛在問題（如燈源老化導(dǎo)致噪音增大、光學(xué)系統(tǒng)偏移導(dǎo)致波長不準(zhǔn)等），從而保證分析結(jié)果的持續(xù)可靠。
參考文獻(xiàn)：
1. GB/T32211-2015：液相色譜用可變波長光度檢測器的測試方法。
2. ASTM E1657-98：Standard Practice for Testing Variable-Wavelength Photometric Detectors Used in Liquid Chromatography.
京公網(wǎng)安備11010802046783號
