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在液相色譜分析過(guò)程中，可能會(huì)遇到各種各樣的問(wèn)題，比如峰形異常，很可能原因是溶劑效應(yīng)、色譜柱不適用或異常，或者化合物存在特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)（如互變、螯合等）等，需要具體排查原因并找到針對(duì)性解決辦法；也可能在方法轉(zhuǎn)移或者重復(fù)特定方法時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)法重現(xiàn)，如果確定色譜柱和流動(dòng)相沒(méi)有問(wèn)題時(shí)，很有可能是儀器系統(tǒng)的差異造成的，特別是滯留體積的差異。我們先認(rèn)識(shí)一下HPLC中涉及到的幾種“體積”。

柱體積（Column Volume）：這是在色譜柱平衡和清洗的時(shí)候經(jīng)常用到的一個(gè)概念。柱體積是指色譜柱內(nèi)能容納液體的最大體積，它和柱管內(nèi)的體積、填料的孔隙率和粒徑等有關(guān)，也被稱為柱空體積/空隙體積（Column Void Volume）。柱體積計(jì)算公式為：

V=nL∗πr^2

對(duì)于不同的填料，系數(shù)n會(huì)有差異。比如對(duì)于某些公司的全多孔（fully porous）硅膠基質(zhì)，這個(gè)系數(shù)n≈0.68，核殼（core-shell）對(duì)應(yīng)的系數(shù)n≈0.55，這樣可以計(jì)算出各種不同規(guī)格的色譜柱的柱體積。

死體積（Dead Volume）：一般是指由進(jìn)樣器開(kāi)始到檢測(cè)器流通池的體積總和。主要包括四個(gè)部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、色譜柱內(nèi)固定相顆粒間隙占據(jù)的體積、柱出口管路體積、檢測(cè)器流通池體積。

系統(tǒng)滯留體積（Dwell Volume）：儀器系統(tǒng)滯留體積是指從流動(dòng)相混合點(diǎn)到色譜柱的柱頭之間的所有的體積，也被稱為延遲體積（Delay Volume），或者梯度延遲體積（Gradient Delay Volume）、駐留體積（Dwell Volume）。對(duì)于梯度方法，不同的滯留體積會(huì)讓實(shí)際的梯度方法有差異，相當(dāng)于在梯度開(kāi)始時(shí)有不同的等度延遲。這種差異可能會(huì)影響梯度方法的重現(xiàn)。因此，EP在推薦色譜柱的同時(shí)，有的還會(huì)注明“dwell volume”以便方法的確認(rèn)。

下面為某實(shí)驗(yàn)室各儀器型號(hào)的滯留體積：

注：儀器滯留體積和外接管路相關(guān)，以上數(shù)據(jù)來(lái)自某實(shí)驗(yàn)室儀器測(cè)試數(shù)據(jù)，僅供參考，具體以實(shí)測(cè)值為準(zhǔn)。

我們?cè)趯?shí)際工作中遇到一個(gè)相關(guān)的案例。在做氨基酸衍生分析時(shí)，當(dāng)使用Waters Arc時(shí)，各色譜峰峰形良好且分離度符合要求；而在相同的色譜條件下使用安捷倫1260時(shí)，部分色譜峰的峰形較差且分離度降低。通過(guò)仔細(xì)排查和分析后，發(fā)現(xiàn)很可能的原因是兩臺(tái)儀器的滯留體積不同。當(dāng)在安捷倫1260儀器的色譜柱前端更換一段比較長(zhǎng)（約50cm）的色譜管線后，使用相同的色譜條件再次進(jìn)行分析，各色譜峰得到了良好分離。

圖1 供應(yīng)商提供典型色譜圖

圖2 使用Waters Arc重現(xiàn)供應(yīng)商方法的色譜圖

圖3 使用Agilent 1260重現(xiàn)供應(yīng)商方法的色譜圖

圖4 使用Agilent 1260并增長(zhǎng)色譜柱前端管線后重現(xiàn)方法的色譜圖

如果想通過(guò)增加管路的方法來(lái)消除不同儀器滯留體積的差異，可以先獲取不同儀器的滯留體積的差異，然后通過(guò)計(jì)算即可得需要增加的管路長(zhǎng)度。通常情況下，在色譜柱前增加空管路（即增加死體積）時(shí)可能會(huì)增加柱外效應(yīng)，即樣品在色譜柱外（包括進(jìn)樣裝置、檢測(cè)池及它們與色譜柱之間的連接管路）由于擴(kuò)散而導(dǎo)致色譜峰展寬的現(xiàn)象。因此當(dāng)遇到這種情況時(shí)，可以優(yōu)先把管路增加到進(jìn)樣器和混合泵之間，以避免柱外效應(yīng)的增加。

全文總結(jié)

本文介紹了三個(gè)HPLC中重要的“體積”（柱體積，死體積，滯留體積）的概念，也分享了一個(gè)因?yàn)闇趔w積差異造成的分析方法重現(xiàn)的問(wèn)題，這是梯度方法轉(zhuǎn)移時(shí)出現(xiàn)重現(xiàn)問(wèn)題的常見(jiàn)原因之一。另外，在分析方法轉(zhuǎn)移及方法復(fù)核之前，需要明確分析方法、關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素（做好風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估）、進(jìn)行可行性研究及現(xiàn)場(chǎng)培訓(xùn)，出現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)溝通，確保分析方法順利轉(zhuǎn)移。