本文聚焦生物發(fā)酵制藥中微生物菌株篩選與改良的策略研究，系統(tǒng)探索微生物菌株篩選與改良策略。研究方法整合傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代技術：傳統(tǒng)方法包括自然篩選和誘變育種；現(xiàn)代技術涉及分子生物學(基因重組、編輯及表達調(diào)控)、代謝工程(網(wǎng)絡分析、系統(tǒng)優(yōu)化、底盤設計)、合成生物學(元件構建、基因線路設計),并結合高通量篩選與人工智能輔助。研究證實，傳統(tǒng)方法仍具應用價值，現(xiàn)代技術可顯著提升菌株性能：其中谷氨酸棒狀桿菌經(jīng)代謝工程改造后賴氨酸產(chǎn)量提升80%,大腸桿菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的產(chǎn)量提升200%,芽孢桿菌通過基因重組技術優(yōu)化后高溫淀粉酶產(chǎn)量增幅超1000%,為生物制藥產(chǎn)業(yè)提供理論支撐與實踐路徑，推動生物產(chǎn)業(yè)智能化、綠色化發(fā)展。
生物發(fā)酵制藥作為現(xiàn)代生物技術的關鍵分支，在抗生素、氨基酸、維生素、酶制劑及重組蛋白藥物等生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。微生物菌株作為發(fā)酵過程的核心，其性能直接決定藥物生產(chǎn)的效率、成本與質(zhì)量。實踐數(shù)據(jù)顯示，通過菌株改良技術，不同類別目標產(chǎn)物產(chǎn)量提升效果顯著：氨基酸類(如賴氨酸)產(chǎn)量可提升 80%[1],小分子化合物類(如1,3-丙二醇)產(chǎn)量提升200%[2-3],酶制劑類(如高溫淀粉酶)產(chǎn)量增幅甚至超1000%[4]。隨著分子生物學、代謝工程及合成生物學等學科的發(fā)展，菌株改良技術從傳統(tǒng)隨機誘變向理性設計轉變[5]。本研究旨在系統(tǒng)剖析生物發(fā)酵制藥中微生物菌株篩選與改良策略，助力產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
Part.01微生物菌株篩選的傳統(tǒng)策略與技術
1.1 自然篩選策略
自然篩選策略基于微生物在自然環(huán)境中的變異特性，通過定向培養(yǎng)和篩選獲取目標菌株。其流程涵蓋樣品采集、預處理、分離純化以及初篩與復篩。從土壤、水體、動植物體表等采集樣本后，經(jīng)高溫、離心等預處理去除雜菌，再用平板劃線法、稀釋涂布法分離單菌落，最后通過形態(tài)觀察、生理生化試驗及目標產(chǎn)物檢測篩選陽性菌株。該方法操作簡便、成本低，無須了解菌株遺傳背景，常用于從極端環(huán)境篩選特殊功能微生物，但存在篩選效率低、周期長、難以獲得性能顯著提升菌株的局限[2]。
1.2誘變育種技術
誘變育種技術借助物理、化學或生物誘變劑處理微生物，誘導基因突變后篩選優(yōu)良性狀菌株，是工業(yè)微生物菌株改良的常用方法。物理誘變劑如紫外線可誘導脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)形成嘧啶二聚體，電離輻射能引起DNA雙鏈斷裂或堿基損傷；化學誘變劑包括堿基類似物、烷化劑、移碼誘變劑等，通過不同機制導致基因突變；生物誘變劑如轉座子可引起插入突變或基因表達調(diào)控改變。篩選時常用抗性篩選、形態(tài)學篩選和高通量篩選等方法。然而，該技術存在隨機性高、表型與基因型關聯(lián)差、多輪誘變效率遞減以及難以改良復雜性狀等問題[6]。
1.3傳統(tǒng)篩選策略的局限性
傳統(tǒng)自然篩選與誘變育種雖取得一定成效，但弊端明顯。誘變育種突變隨機，需大規(guī)模篩選；難以針對目標代謝途徑改良，常出現(xiàn)生長缺陷等負效應；長期誘變會導致基因組損傷積累，菌株性能提升幅度下降；對于多基因協(xié)同調(diào)控的復雜性狀改良效果不佳，這促使新型菌株改良策略發(fā)展[7-8]。
Part.02基于分子生物學的菌株改良策略
2.1基因重組技術基因重組技術通過體外DNA進行操作，將目的基因?qū)胧荏w菌株，實現(xiàn)基因功能定向改變。質(zhì)粒介導的基因克隆需構建合適載體，插入目的基因及調(diào)控元件，再導入受體菌篩選陽性克隆，并優(yōu)化目的基因表達水平；染色體整合技術利用同源重組或轉座子介導整合，可避免質(zhì)粒丟失問題。該技術已廣泛應用于酶制劑生產(chǎn)菌株改良，如將高溫淀粉酶基因?qū)胙挎邨U菌，提升酶的熱穩(wěn)定性和表達量[9]。
2.2 基因編輯技術的發(fā)展與應用
人工智能輔助新藥研發(fā)所展現(xiàn)出的能力和潛力得到了全球主流藥企認可，規(guī)律間隔成簇短回文重復序列相關蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteing, CRISPR-Cas9)作為第三代基因編輯技術，憑借高效性和簡便性成為菌株改良核心工具。它由 Cas9 核酸酶和單導核糖核酸 (single guide ribonucleic acid, sgRNA) 組成，可精準切割目標DNA 序列，觸發(fā)細胞 DNA 修復機制，實現(xiàn)基因敲除、敲入或定點突變，在基因敲除、調(diào)控及多基因編輯等方面廣泛應用。此外，鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFN)、類轉錄激活因子效應核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)、CRISPR關聯(lián)蛋白(CRISPR-associated protein, CRISPR-Cpf1) 等基因編輯技術也各有特點和應用范圍。
2.3 表達調(diào)控網(wǎng)絡優(yōu)化
微生物代謝表型是基因表達調(diào)控網(wǎng)絡綜合作用的結果，該網(wǎng)絡精密調(diào)控著細胞內(nèi)各類代謝活動。因此，優(yōu)化這一網(wǎng)絡成為提升目標產(chǎn)物合成效率的關鍵突破口。啟動子作為基因表達起始的關鍵元件，其工程通過篩選微生物基因組中天然存在的具有不同強度和調(diào)控特性的啟動子，利用易錯聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)等手段進行定向進化，或基于核心序列從頭設計合成啟動子，實現(xiàn)對基因表達水平的精準把控。轉錄后調(diào)控層面，優(yōu)化核糖體結合位點(ribosome binding site, RBS)序列能增強信使RNA(messenger RNA,mRNA)與核糖體的結合效率；小RNA(sRNA)可特異性結合靶標 mRNA,調(diào)控其穩(wěn)定性與翻譯過程；核糖“開關”則能響應代謝物信號，動態(tài)調(diào)節(jié)基因表達，這些調(diào)控方式協(xié)同作用，有效提升菌株合成目標產(chǎn)物的性能。
Part.03代謝工程導向的菌株改良策略
3.1 代謝網(wǎng)絡分析與途徑重構
代謝工程通過系統(tǒng)分析微生物代謝網(wǎng)絡，設計基因操作優(yōu)化目標產(chǎn)物合成途徑。包括解析目標產(chǎn)物合成途徑，構建從頭合成途徑或優(yōu)化天然途徑；通過增強前體供應、阻斷競爭途徑、平衡輔酶因子供應等方式，實現(xiàn)代謝通量重分配，提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量，如表1所示。
表1 代謝途徑重構主要優(yōu)化策略及應用
3.2 系統(tǒng)代謝工程策略
系統(tǒng)代謝工程通過整合多組學數(shù)據(jù)與計算生物學模型，搭建起代謝網(wǎng)絡全局優(yōu)化的系統(tǒng)性框架。借助轉錄組學技術可解析不同生理狀態(tài)下的基因表達譜，代謝組學能精準檢測胞內(nèi)代謝物濃度動態(tài)變化，蛋白質(zhì)組學則揭示蛋白質(zhì)互作與修飾調(diào)控機制。通過轉錄組學、代謝組學、蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)的交叉分析(如基于生物信息學工具對差異表達基因、關鍵代謝物及互作蛋白進行關聯(lián)映射),可定位代謝網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點與潛在瓶頸(表2)。在此基礎上，結合基因組規(guī)模代謝模型(如大腸桿菌 iJO1366 模型)與通量平衡分析(FBA)等計算工具，通過數(shù)學建模預測不同基因擾動或環(huán)境條件下代謝通量分布，進而指導基因敲除、過表達等改造策略的設計，實現(xiàn)從局部途徑優(yōu)化到全局代謝網(wǎng)絡重分配的精準調(diào)控，為菌株高效生產(chǎn)目標產(chǎn)物提供數(shù)據(jù)驅(qū)動的理性改造方案[9]。
3.3 底盤細胞設計
底盤細胞是經(jīng)定向改造、適配制藥需求的 “標準化生產(chǎn)平臺”,核心技術有：對大腸桿菌等模式菌用基因組精簡剔除冗余基因、定制代謝網(wǎng)絡，如精簡大腸桿菌生長速率，提高至30%[5];對非模式/極端菌通過代謝網(wǎng)絡重構“適配” 合成模塊、基因編輯改特殊代謝機制；用標準化元件接口改造實現(xiàn) “一底盤多產(chǎn)品”。其側重宿主架構優(yōu)化，與系統(tǒng)代謝工程的全局通量調(diào)控形成 “基礎—應用” 遞進。
表2 代謝工程主要策略及應用案例
Part.04合成生物學驅(qū)動的菌株創(chuàng)新改良
4.1 標準化生物元件構建
合成生物學以工程化理念重塑微生物改造邏輯，通過設計標準化、模塊化的生物元件，構建可預測、可復用的“生物積木”體系，從而實現(xiàn)微生物功能的定向編程。在基因表達層面，標準化元件包括強度可量化的啟動子(如大腸桿菌 lac 啟動子)、翻譯效率可控的核糖體結合位點(RBS)及高效轉錄終止子，形成基因表達的 “開關系統(tǒng)”;代謝功能模塊則將復雜代謝途徑拆解為獨立功能單元，如萜類合成模塊、脂肪酸延伸模塊，配合四環(huán)素響應調(diào)控模塊等實現(xiàn)途徑動態(tài)調(diào)控；細胞行為控制元件如 LuxI/LuxR 群體感應系統(tǒng)，可同步菌群代謝行為，而芽孢桿菌細胞周期調(diào)控元件能分離生長與合成階段。這些標準化元件通過模塊化組裝，賦予微生物底盤定制化的代謝生產(chǎn)能力[6]。
4.2 人工基因線路設計
人工基因線路通過組合生物元件設計遺傳調(diào)控網(wǎng)絡，賦予微生物新功能或優(yōu)化現(xiàn)有功能。邏輯門電路實現(xiàn)不同信號響應下的基因表達調(diào)控；振蕩系統(tǒng)使基因表達周期性變化，提高代謝產(chǎn)物合成效率；記憶系統(tǒng)記錄細胞歷史狀態(tài)，用于環(huán)境脅迫響應或產(chǎn)物合成時序調(diào)控。組合生物合成通過模塊化重組生物合成基因簇，可重構次級代謝途徑以創(chuàng)造新型化合物，或優(yōu)化關鍵酶組合提升目標產(chǎn)物產(chǎn)量。
4.3 合成生物學在菌株改良中的前沿應用
合成生物學在復雜天然產(chǎn)物全合成、細胞工廠智能化設計和基因組編輯重編程等方面展現(xiàn)出巨大潛力。在酵母菌中重構阿片類生物堿合成途徑，突破傳統(tǒng)提取限制；設計智能響應系統(tǒng)，使微生物自動調(diào)整代謝通量；構建最小基因組，優(yōu)化生產(chǎn)底盤。
Part.05菌株篩選與改良的高通量技術平臺
5.1 高通量篩選技術
微流控芯片技術利用納升級反應單元實現(xiàn)單個細胞培養(yǎng)與篩選，高通量且低試劑消耗；流式細胞術結合熒光報告蛋白，可快速分選海量細胞；自動化篩選平臺整合多種設備，實現(xiàn)菌株培養(yǎng)到活性檢測全流程自動化，大幅提高篩選效率。定向進化技術通過易錯 PCR、DNA shuffling 構建基因突變庫，結合酵母表面展示/噬菌體展示(用于酶等蛋白突變體的高效篩選),可定向優(yōu)化功能蛋白活性，為菌株性能提供精準靶向改良手段。
5.2 人工智能在菌株設計中的應用
機器學習預測模型通過監(jiān)督學習(以已知基因-表型關聯(lián)數(shù)據(jù)為標簽，訓練隨機森林、神經(jīng)網(wǎng)絡等模型)或無監(jiān)督學習(對多組學數(shù)據(jù)聚類，挖掘未知基因-型關聯(lián))分析多組學數(shù)據(jù)，構建精準基因-表型映射模型，高效預測菌株改良靶點。自動化設計平臺結合計算模型與機器學習，實現(xiàn)菌株設計流程智能化，加速開發(fā)進程。
Part.06結 論
生物發(fā)酵制藥中微生物菌株篩選與改良技術經(jīng)歷了從傳統(tǒng)到現(xiàn)代的演進。傳統(tǒng)篩選策略如自然篩選、誘變育種雖存在一定局限性，但仍在特定場景發(fā)揮作用；基于分子生物學、代謝工程和合成生物學的現(xiàn)代技術，實現(xiàn)了對菌株的精準設計與高效改造，顯著提升了目標產(chǎn)物產(chǎn)量與生產(chǎn)效率。高通量篩選技術和人工智能的應用，進一步加速菌株開發(fā)進程。未來，隨著多學科交叉融合的深入，菌株改良技術將朝著智能化、綠色化、高效化方向發(fā)展，有望攻克更多技術難題，為生物發(fā)酵制藥產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展注入強勁動力。
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