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一 LER 的現(xiàn)象

根據(jù)2025年版《中國藥典》9251，“低內(nèi)毒素回收，也稱為內(nèi)毒素掩蔽，是指無法使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法正常檢測(cè)到樣品中的加標(biāo)內(nèi)毒素的現(xiàn)象。”

LER（低內(nèi)毒素回收，Low Endotoxin Recovery）現(xiàn)象與干擾現(xiàn)象的區(qū)別：

干擾現(xiàn)象為內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)被抑制，其主要原因是反應(yīng)溶液非處于最佳的反應(yīng)條件，如pH值非最佳、陽離子濃度失衡、非特異性酶反應(yīng)等。該反應(yīng)條件引起的反應(yīng)抑制可通過樣品稀釋加以消除。

LER現(xiàn)象為樣品中的內(nèi)毒素隨著時(shí)間的推移，其回收率逐漸降低，且不能通過稀釋的方式消除。

二 LER現(xiàn)象產(chǎn)生的原因

LER現(xiàn)象產(chǎn)生的原因基于如下的假設(shè)，即內(nèi)毒素的超分子狀態(tài)（supermolecular state）發(fā)生改變從而使得其難以被檢測(cè)（又稱為掩蔽mask）。其形成機(jī)制分為兩步，第一步是內(nèi)毒素中的二價(jià)陽離子被螯合，第二步是內(nèi)毒素分子的聚集狀態(tài)發(fā)生改變。

LER現(xiàn)象在生物制品中較為常見，因其處方中存在LER現(xiàn)象形成的因素。生物制品處方中通常含有檸檬酸鹽、組氨酸、磷酸鹽等成分，其與內(nèi)毒素分子中的二價(jià)陽離子螯合，從而發(fā)生第一步反應(yīng)；處方中的表面活性劑，如吐溫20、吐溫80使得內(nèi)毒素分子的聚集狀態(tài)發(fā)生改變，從而發(fā)生第二步反應(yīng)。

此外，生物制品中的蛋白質(zhì)分子也可能與二價(jià)陽離子結(jié)合和/或改變內(nèi)毒素分子的聚集狀態(tài)，從而對(duì)第一步反應(yīng)或第二步反應(yīng)都產(chǎn)生潛在的影響。

三 判斷是否存在LER的試驗(yàn)方法

藥典規(guī)定，“判斷低內(nèi)毒素回收的方法是將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素添加到未稀釋的樣品中，隨著時(shí)間的推移，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的回收率無法達(dá)到≥50%。”然而藥典未提供更多的試驗(yàn)細(xì)節(jié)。

PDA第82號(hào)技術(shù)報(bào)告提供了詳細(xì)的方法參數(shù)：

1內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法：與日常的內(nèi)毒素檢驗(yàn)方法相同，包括（但不限于）相同來源的鱟試劑和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、相同的樣品前處理方法、相同的數(shù)據(jù)分析方法、樣品稀釋不得超過MVD。

2內(nèi)毒素添加到未稀釋的樣品：使用CSE（Control Standard Endotoxin）或RSE（Reference Standard Endotoxin）加標(biāo)樣品，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的體積不得超過加標(biāo)后樣品總體積的10%，加標(biāo)后內(nèi)毒素的濃度一般為5 EU/mL（動(dòng)態(tài)法）或按照內(nèi)毒素檢驗(yàn)法進(jìn)行樣品稀釋可以證明干擾試驗(yàn)的回收率為50-200%（凝膠法）。

可采用兩種加標(biāo)的策略，一種為樣品加標(biāo)內(nèi)毒素后進(jìn)行分裝，在不同的時(shí)間進(jìn)行內(nèi)毒素檢驗(yàn)；另外一種在不同的日期進(jìn)行內(nèi)毒素加標(biāo)，最后在同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)所有的加標(biāo)樣品同時(shí)進(jìn)行檢驗(yàn)。

3內(nèi)毒素加標(biāo)試驗(yàn)的容器：使用不吸附內(nèi)毒素且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾的容器。

4加標(biāo)樣品的批次數(shù)：3批。

5加標(biāo)后樣品的儲(chǔ)存時(shí)間和儲(chǔ)存溫度：根據(jù)制劑生產(chǎn)工藝中有LER風(fēng)險(xiǎn)的工藝步驟（參照2. LER產(chǎn)生的原因進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估）和內(nèi)毒素污染風(fēng)險(xiǎn)的工藝步驟的溫度、時(shí)長(zhǎng)確定加標(biāo)后樣品的儲(chǔ)存時(shí)間和儲(chǔ)存溫度。

6對(duì)照：使用內(nèi)毒素檢查用水代替樣品進(jìn)行內(nèi)毒素加標(biāo)試驗(yàn)，作為對(duì)照。

7測(cè)試時(shí)間點(diǎn)：至少測(cè)試4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)加標(biāo)內(nèi)毒素的樣品和對(duì)照同時(shí)進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。

8判斷標(biāo)準(zhǔn)：以加標(biāo)樣品的內(nèi)毒素濃度除以對(duì)照的內(nèi)毒素濃度，計(jì)算內(nèi)毒素回收率。

如連續(xù)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的回收率低于50%，則表明有LER現(xiàn)象；

如僅有一個(gè)時(shí)間點(diǎn)回收率低于50%，則需要進(jìn)行額外時(shí)間點(diǎn)的測(cè)試以進(jìn)一步確認(rèn)是否有LER現(xiàn)象；

如所有時(shí)間點(diǎn)的回收率均不低于50%，則表明無LER現(xiàn)象。

四 LER現(xiàn)象的解決措施

藥典規(guī)定，“對(duì)于存在低內(nèi)毒素回收現(xiàn)象的產(chǎn)品，可通過調(diào)整樣品處理或試驗(yàn)方法來恢復(fù)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)能力。緩解低內(nèi)毒素回收的措施應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品本身特性，采用在樣品中添加分散劑、添加過量的二價(jià)金屬離子、使用有機(jī)溶劑增加樣品的疏水性等方式。如無法緩解低內(nèi)毒素回收現(xiàn)象，應(yīng)采用熱原檢查法或其他替代方法。”

PDA第82號(hào)技術(shù)報(bào)告還提出了對(duì)蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)和疏水性進(jìn)行分析，以評(píng)估由蛋白質(zhì)引起的LER現(xiàn)象，且有文獻(xiàn)報(bào)道可通過蛋白酶加以消除。此外，不同來源的鱟試劑對(duì)LER的形成亦有影響，故也可通過更換鱟試劑來源消除LER現(xiàn)象。

緩解LER現(xiàn)象的常用試劑：