【摘要】2025 年版《中國藥典》新增 9213“藥品微生物分析方法驗證、確認及轉(zhuǎn)移指導(dǎo)原則”，從藥品微生物分析方法的特點出發(fā)，結(jié)合應(yīng)用實例，明確了開展藥品微生物分析方法驗證、確認及轉(zhuǎn)移中的相關(guān)術(shù)語和應(yīng)用場景，并通過引入關(guān)鍵統(tǒng)計工具、提出評價原則，確定了方法學(xué)考察的技術(shù)指標及可接受限度。本文系統(tǒng)闡述該指導(dǎo)原則的起草背景、起草過程，并對重點內(nèi)容進行解讀，以期為相關(guān)從業(yè)者應(yīng)用該指導(dǎo)原則提供理論指導(dǎo)與實踐參考。該指導(dǎo)原則夯實了我國藥品微生物分析方法的基礎(chǔ)，提升了藥品微生物標準系統(tǒng)的科學(xué)性和準確性。
【關(guān)鍵詞】微生物分析方法; 驗證; 確認; 轉(zhuǎn)移; 方法適用性試驗
藥物分析檢測技術(shù)是保障藥品安全性、有效性的重要防線。只有采用科學(xué)合理的分析方法，才能獲得準確可靠的結(jié)果?？茖W(xué)地建立與使用分析方法需要進行適宜的方法學(xué)考察和評價。為此，2025 年版《中國藥典》編制大綱明確提出“提升藥品標準整體水平，進一步提高藥品安全性、有效性保障，加強專屬性強的檢測方法及標準限度的制定，強化高風(fēng)險品種安全性控制指標”的要求［1］。由于《中國藥典》2020 年版已收載的分析方法驗證、確認和轉(zhuǎn)移指導(dǎo)原則不適用于微生物分析方法，“9213 藥品微生物分析方法驗證、確認及轉(zhuǎn)移指導(dǎo)原則”( 簡稱指導(dǎo)原則 9213) 的制定，對支持新技術(shù)和新方法的發(fā)展、規(guī)范方法及標準的制修訂、提升質(zhì)量控制水平、保證微生物分析方法在藥品領(lǐng)域的科學(xué)應(yīng)用等具有重要意義［2］。本文介紹該指導(dǎo)原則的起草背景，并對其關(guān)鍵技術(shù)指標、標準適用范圍及技術(shù)實施要點等內(nèi)容進行解讀。
01起草背景
1.1 標準現(xiàn)狀
分析方法的驗證、確認是保證檢測結(jié)果準確可靠的基礎(chǔ)，也是對檢測實驗室的通用要求。世界各國的認可機構(gòu)，如澳大利亞認可委員會［3］( National Association of Testing Authorities，Australia，NATA) 、新加坡認可委［4］( Singapore Accreditation Council，SAC) 及中國合格評定國家認可委員會［5］( China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS) 等都發(fā)布有針對實驗室進行分析方法驗證和確認的基本要求，應(yīng)用較廣泛的標準有國際標準組織 ( International Organization for Standardization，ISO) 的 ISO 17025［6］、我國的國家標準 GB /T27025［7］等。同樣，世界各國藥品監(jiān)管機構(gòu)及行業(yè)組織等也要求對藥品分析/檢驗方法應(yīng)進行充分的驗證或確認。
然而，國內(nèi)外藥品監(jiān)管機構(gòu)如美國食品藥品監(jiān)督管理局 ( U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA) ［8］、歐洲藥品監(jiān)督管理局( European Medicines Agency，EMEA) ［9］、人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會 ( International Conference on Harmonization of Technical Ｒequirements for Ｒegistration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH ) ［10，11］、世界衛(wèi)生組織( World Health Organization，WHO ) ［12］、各國藥典［13-14］包括《中國藥典》2020 年版［15］等已發(fā)布的關(guān)于分析方法驗證、轉(zhuǎn)移、確認的相關(guān)法規(guī)和標準，都僅適用于理化分析方法，目前尚無具體針對藥品微生物分析方法驗證、確認及轉(zhuǎn)移的相關(guān)法規(guī)和標準。由于影響藥品微生物分析方法的因素較多，特別是樣品中微生物分布的不均勻性，導(dǎo)致微生物試驗分析方法本身存在較大的不確定度，因而，微生物分析方法較理化分析方法更復(fù)雜。目前，各國藥典中僅在介紹微生物快速檢測方法或替代方法時涉及部分與微生物分析方法驗證相關(guān)的要求［16-19］，覆蓋不全面。
與此同時，相近領(lǐng)域如食品、環(huán)境微生物等，對分析方法的驗證和確認要求日漸完善。我國早在2012 年即發(fā)布 SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗方法確認技術(shù)規(guī)范》，近年來又更新了 ＲB /T 033-2020《微生物檢測方法確認與驗證指南》和 GB 4789. 45-2023《食品安全國家標準 微生物學(xué)檢驗方法驗證通則》。國際上 ISO 17468［20］和 ISO 16140［21-25］系列標準，詳細闡述了食品鏈的微生物檢測新建/替代方法的驗證和確認要求，包括實驗內(nèi)及實驗室間驗證和確認的參數(shù)、統(tǒng)計方法及 可接受限度。ISO13843［26］規(guī)定了對水中微生物定量方法的確認要求。美國分析化學(xué)家協(xié)會( Association of Official Agricultural Chemists，AOAC) ［27］也發(fā)布有針對食品、環(huán)境相關(guān)的微生物檢測方法驗證指導(dǎo)原則。
1.2 我國的行業(yè)現(xiàn)狀
伴隨著微生物檢驗理念和技術(shù)的進步，制藥領(lǐng)域不斷引入新的微生物分析方法，但如何判斷所選擇的方法是否適合于相應(yīng)的檢驗?zāi)康? 如何判斷或證明一個微生物檢驗實驗室是否具備相應(yīng)的檢測能力? 成為亟待解決的新問題。同時，在對藥品微生物分析方法的應(yīng)用現(xiàn)狀進行調(diào)研時發(fā)現(xiàn)，業(yè)內(nèi)對微生物分析方法涉及的相關(guān)術(shù)語和內(nèi)涵理解不正確，常將“方法驗證”“方法確認”“方法轉(zhuǎn)移”和“方法適用性( suitability testing) ”等概念混淆。因而，亟須建立相應(yīng)的技術(shù)要求，指導(dǎo)如何對微生物分析方法進行驗證、確認及轉(zhuǎn)移，進而規(guī)范微生物分析方法的應(yīng)用。
02起草過程
從標準起草的規(guī)范性和科學(xué)性出發(fā)，通過梳理國內(nèi)外與分析方法相關(guān)的標準、法規(guī)，重點參考相近領(lǐng)域微生物分析方法的參數(shù)設(shè)置及統(tǒng)計方法( 表1) ，同時結(jié)合當(dāng)前我國的標準現(xiàn)狀、執(zhí)行過程中行業(yè)的反饋意見和藥品微生物分析方法的需求開展起草工作。為保證分析結(jié)果的準確性和相關(guān)參數(shù)設(shè)置的科學(xué)性，分別通過開展藥品微生物定性分析方法和定量分析方法的實例研究，組織實驗室內(nèi)和實驗室間的復(fù)核檢驗，探討技術(shù)指標設(shè)置的合理性及指導(dǎo)原則的實際應(yīng)用場景。
▲表1-指導(dǎo)原則 9213 起草中參考的相關(guān)標準
03主要內(nèi)容解讀
3.1 主要框架
參照《中國藥典》2020 年版四部通則 9099、9100、9101 及 9201 的體例，指導(dǎo)原則 9213 整體分為三部分，分別為藥品微生物分析方法驗證、方法確認和方法轉(zhuǎn)移( 表 2) 。
▲表2-指導(dǎo)原則框架和內(nèi)容要點
3.2 指導(dǎo)原則 9213 中的關(guān)鍵點
3.2.1 術(shù)語標準化
方法適用性與方法驗證、方法確認、方法轉(zhuǎn)移等概念既相互聯(lián)系又有區(qū)別［28］，目的都為了保證檢測方法的準確可靠，但由于檢測目的、檢測對象、檢測人員、檢測條件等因素的不同，以上幾個概念的內(nèi)涵和側(cè)重點又有所不同( 表3) 。指導(dǎo)原則 9213 明確了藥品微生物分析方法的驗證、確認、轉(zhuǎn)移等相關(guān)定義。
▲表3-術(shù)語的聯(lián)系與區(qū)別
3.2.2 具體使用情境
指導(dǎo)原則 9213 首次明確了藥品微生物分析方法驗證、確認及轉(zhuǎn)移等的適用情境，包括但不限于以下示例( 表 4) 。方法驗證側(cè)重于新方法的開發(fā)與方法修訂等環(huán)節(jié)。方法確認根據(jù)應(yīng)用場景要求有所不同: 對從未進行過藥品微生物分析的新建實驗室，建議參考指導(dǎo)原則表 2“微生物分析方法確認推薦參數(shù)”對定性或定量方法進行確認; 對已長期開展無菌或微生物限度檢查的實驗室，仍可按藥典通則 1101、通則 1105 等中的方法適用性試驗對具體品種進行無菌或微生物限度檢查方法的確認。上述通則中的方法適用性試驗是方法確認的一種具體形式。
▲表4-微生物方法驗證、確認、轉(zhuǎn)移和方法適用性的使用情境示例
3.2.3 參數(shù)科學(xué)量化
指導(dǎo)原則 9213 為推薦性指導(dǎo)原則，所列參數(shù)供方法開發(fā)者或使用者綜合評估后使用。在進行方法驗證時，一般定性方法至少選擇檢測限，定量方法至少選擇準確度進行實驗室間驗證。
檢測限: 首次引入配對與非配對分析模型，解決“無參考方法”的檢測限驗證的難題。同時，推薦了POD( probability of detection) 等適宜統(tǒng)計方法，與國際標準體系接軌。
準確度: 在保留傳統(tǒng)的回收率基礎(chǔ)上，增加了統(tǒng)計參數(shù)容忍區(qū)間。該統(tǒng)計參數(shù)聯(lián)合評估方法的精密度和重復(fù)性，使統(tǒng)計結(jié)果更加科學(xué)。
不確定度: 首次提出必要時微生物定量方法需評定其不確定度，涵蓋樣品因素( 質(zhì)量和體積等) 和非樣品等因素( 操作者、時間、設(shè)備、培養(yǎng)基和試劑等) 。
3.3 與藥典其他相關(guān)通則的關(guān)系
指導(dǎo)原則 9213 作為微生物分析方法的基礎(chǔ)，與《中國藥典》多個通則和指導(dǎo)原則緊密聯(lián)系( 圖 1) ，應(yīng)參考協(xié)調(diào)使用。
▲圖1-《中國藥典》現(xiàn)有部分微生物相關(guān)通則的關(guān)系
對替代以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的經(jīng)典微生物檢驗方法的驗證，可參照藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則( 指導(dǎo)原則 9201) 實施。微生物鑒定方法的驗證和確認按微生物鑒定指導(dǎo)原則( 指導(dǎo)原則 9204)實施。
首次使用法定方法進行檢驗時，應(yīng)首先確保實驗室的人員、儀器設(shè)備等滿足藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則( 指導(dǎo)原則 9203) 的相關(guān)要求。經(jīng)評估實驗室及分析人員有能力開展微生物法定分析后，方可采用該法定方法進行試驗。對按照無菌檢查法( 通則 1101) 、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查: 微生物計數(shù)法( 通則 1105) 、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查: 控制菌檢查法( 通則 1106) 或中藥飲片微生物限度檢查法( 通則 1108) 進行檢驗的具體品種，可按相應(yīng)通則中的方法適用性試驗進行方法確認。
04總結(jié)與展望
方法驗證、確認和轉(zhuǎn)移是一項系統(tǒng)、科學(xué)、復(fù)雜的工作。微生物分析方法的檢測對象是微生物活體，存在更多的不確定性，因而困難更多，要求更高。指導(dǎo)原則 9213 在堅持科學(xué)性的基礎(chǔ)上，注重可操作性，可作為方法開發(fā)機構(gòu)、藥品生產(chǎn)企業(yè)、檢驗檢測等進行微生物分析方法驗證、確認及轉(zhuǎn)移的重要參考依據(jù)。
2025 年版《中國藥典》新增的指導(dǎo)原則 9213是各國藥典中首個針對微生物分析方法的指導(dǎo)原則，其率先明確了藥品微生物分析方法驗證、確認、轉(zhuǎn)移的定義，確定了方法學(xué)考察的統(tǒng)計方法、技術(shù)指標及可接受限度，為微生物實驗室建立 /選擇適宜的分析方法提供了解決方案。該指導(dǎo)原則的頒布將有助于推動新藥品微生物分析方法的應(yīng)用，提升藥品微生物分析的水平，進而促進我國藥品微生物標準的提升。
參考文獻
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