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樣品稀釋是微生物定量檢測(cè)（如菌落總數(shù)、大腸菌群等）中最關(guān)鍵、也是最容易引入誤差的環(huán)節(jié)。其核心目的是將樣品中的微生物濃度降低到可計(jì)數(shù)的范圍（通常為30-300 CFU/平板）。

 

一、 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. 器具與試劑：

無(wú)菌稀釋液：最常用的是生理鹽水（0.85% NaCl），或磷酸鹽緩沖液。確保在有效期內(nèi)且無(wú)菌。

無(wú)菌試管：用于分裝稀釋液，通常準(zhǔn)備9mL/管。

無(wú)菌吸頭/移液管：量程需覆蓋1mL和0.1mL（或1mL及后續(xù)稀釋轉(zhuǎn)移量）。必須是無(wú)菌的！

微量移液器：定期校準(zhǔn)，確保精度。

均質(zhì)袋/均質(zhì)杯：用于固體或半固體樣品的初始均質(zhì)。

渦旋振蕩器：用于充分混勻樣品。

標(biāo)記筆：防水，能在玻璃或塑料上清晰書寫。

培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基：預(yù)先準(zhǔn)備好并標(biāo)記清楚。

2. 環(huán)境與個(gè)人準(zhǔn)備：

超凈工作臺(tái)/生物安全柜： 所有稀釋操作必須在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。使用前開啟紫外燈滅菌30分鐘，并用75%酒精擦拭臺(tái)面。

個(gè)人防護(hù)： 穿實(shí)驗(yàn)服，戴手套、口罩和帽子。手套用酒精消毒。

 

二、 梯度稀釋詳細(xì)步驟（以10倍系列稀釋法為例）

假設(shè)您有一個(gè)液體樣品，預(yù)計(jì)菌落總數(shù)為 10? CFU/mL。

第1步：樣品均質(zhì)

對(duì)于液體樣品，劇烈振搖數(shù)次，確保微生物分布均勻。

對(duì)于固體樣品，按標(biāo)準(zhǔn)（如1：10）加入稀釋液，在均質(zhì)袋中充分拍擊或均質(zhì)器上均質(zhì)1-2分鐘。

第2步：設(shè)置稀釋梯度與標(biāo)記

規(guī)劃梯度： 根據(jù)樣品類型和預(yù)估菌量，設(shè)計(jì)稀釋度。對(duì)于預(yù)估10? CFU/mL的樣品，通常選擇10??， 10??， 10?? 三個(gè)稀釋度進(jìn)行涂布或傾注平板。

清晰標(biāo)記： 在每一支含9mL稀釋液的試管上，清晰地標(biāo)記稀釋度：

10?¹， 10?²， 10?³， 10??， 10??， 10?? （多準(zhǔn)備幾個(gè)以備不時(shí)之需）

同時(shí)在培養(yǎng)皿上標(biāo)記好樣品編號(hào)、稀釋度和日期。

第3步：進(jìn)行系列稀釋（核心操作）

原則：從低濃度向高濃度操作，即“從低往高吹”。

1、制備10?¹稀釋液：

用無(wú)菌移液器吸取 1mL 原樣品。

將吸頭尖端伸入標(biāo)記為“10?¹”的試管液面以下，緩慢、平穩(wěn)地將液體打出。

將試管蓋緊，立即在渦旋振蕩器上振蕩混勻10-15秒，確保微生物充分分散。此為10?¹稀釋液。

2、制備10?²稀釋液：

更換一個(gè)新的無(wú)菌吸頭！

從剛剛混勻的“10?¹”試管中吸取 1mL 液體。

將吸頭伸入“10?²”試管液面下，緩慢打出液體。

蓋緊試管，渦旋振蕩混勻。此為10?²稀釋液。

3、制備后續(xù)稀釋液：

重復(fù)上述步驟：更換吸頭 → 從上一個(gè)稀釋度吸取1mL → 加入下一個(gè)9mL試管 → 渦旋混勻。

依次制備出10?³， 10??， 10??， 10??等稀釋液。

第4步：接種與培養(yǎng)

選擇2-3個(gè)最可能落在30-300 CFU范圍內(nèi)的稀釋度（本例中為10??， 10??， 10??）進(jìn)行接種。

每個(gè)稀釋度建議做2-3個(gè)平行平板，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

涂布法： 吸取0.1mL稀釋液到固體培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌涂布棒涂勻。

傾注法： 吸取1mL稀釋液至無(wú)菌平皿中，然后倒入約15-20mL冷卻至45-50℃的熔融培養(yǎng)基，立即輕輕搖勻。

按照目標(biāo)微生物的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。

 

三、 誤差控制要點(diǎn)與技巧

誤差控制是獲得可靠數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。主要誤差來(lái)源及控制方法如下：

1. 移液誤差

定期校準(zhǔn)移液器： 這是最容易被忽視但至關(guān)重要的一點(diǎn)。

正確使用移液器：

吸液時(shí)保持垂直，慢吸慢放。

對(duì)于高粘度樣品，采用“反向移液法”，可以提高精度。

預(yù)潤(rùn)洗吸頭：對(duì)于某些樣品或稀釋液，先吸放一次液體，使吸頭內(nèi)壁達(dá)到平衡，可以提高準(zhǔn)確性。

使用合適的吸頭： 使用與移液器品牌匹配的高質(zhì)量無(wú)菌吸頭。

2. 交叉污染

一管一吸頭： 絕對(duì)禁止 用一個(gè)吸頭接觸兩個(gè)不同濃度的稀釋液。這是導(dǎo)致梯度失敗最常見的原因。

操作順序： 嚴(yán)格遵守 “從低濃度到高濃度” 的順序。這樣即使有微量液體濺出，也不會(huì)污染更高濃度的樣品。

避免產(chǎn)生氣溶膠： 吹打液體時(shí)，動(dòng)作要輕柔，吸頭尖端始終保持在液面以下，避免產(chǎn)生氣泡和氣溶膠。

3. 混合不充分

必須渦旋振蕩： 每次移液前，都必須將試管充分渦旋振蕩。簡(jiǎn)單顛倒混勻往往不足以使微生物細(xì)胞均勻分散，導(dǎo)致同一稀釋度的平行平板間計(jì)數(shù)差異巨大。

時(shí)間要保證： 每次振蕩10-15秒是必要的。

4. 時(shí)間與溫度誤差

快速操作： 從樣品制備到稀釋完成，再到接種，時(shí)間應(yīng)盡可能短。微生物在稀釋液中會(huì)因營(yíng)養(yǎng)缺乏、pH變化等而死亡或增殖。

控制溫度： 對(duì)溫度敏感的樣品，整個(gè)稀釋過(guò)程應(yīng)在冰上進(jìn)行，但需注意稀釋液溫度過(guò)低可能對(duì)某些微生物造成冷休克。

5. 稀釋液與器具

確認(rèn)無(wú)菌： 使用前檢查稀釋液和試管的有效期及無(wú)菌狀態(tài)。

質(zhì)量保證： 確保稀釋液的pH和滲透壓適合目標(biāo)微生物的存活。

6. 設(shè)置對(duì)照

稀釋液空白： 取1mL稀釋液加入平板中，進(jìn)行與樣品相同的操作，以確認(rèn)稀釋液和器具無(wú)菌。

環(huán)境監(jiān)測(cè)： 在操作過(guò)程中，打開一個(gè)空的培養(yǎng)皿放置幾分鐘，以監(jiān)測(cè)超凈工作臺(tái)的無(wú)菌狀況。

 

四、 結(jié)果判讀與常見問(wèn)題

選擇可計(jì)數(shù)平板： 優(yōu)先選擇菌落數(shù)在30-300 CFU之間的平板。如果一個(gè)稀釋度的兩個(gè)平板都在此范圍，取平均值。如果一個(gè)高于300，一個(gè)低于30，且兩者倍數(shù)關(guān)系不大，則數(shù)據(jù)可能不可靠，需重做。

常見問(wèn)題分析：

“跳管”現(xiàn)象： 某個(gè)稀釋度的計(jì)數(shù)遠(yuǎn)高于或低于預(yù)期。原因通常是移液錯(cuò)誤、未換吸頭導(dǎo)致交叉污染、或混合不充分。

所有平板菌落都過(guò)多（>300）： 初始稀釋度設(shè)置過(guò)低，下次檢測(cè)需增加稀釋梯度。

所有平板菌落都過(guò)少（<30）： 初始稀釋度設(shè)置過(guò)高，或樣品本身含菌量極低。

平行平板差異巨大： 最可能的原因是混合不充分或移液操作不規(guī)范。

 

總結(jié)：

成功的微生物稀釋操作 = 規(guī)范的操作流程 + 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臒o(wú)菌觀念 + 對(duì)細(xì)節(jié)的極致關(guān)注。將上述步驟和誤差控制要點(diǎn)內(nèi)化為習(xí)慣，是獲得可靠微生物定量數(shù)據(jù)的基石。