一、四環(huán)素類(lèi)藥物簡(jiǎn)介
四環(huán)素類(lèi)抗生素是一類(lèi)具有氫化并四苯基本骨架的廣譜抗生素。20世紀(jì)40年代首個(gè)四環(huán)素類(lèi)藥物—金霉素被發(fā)現(xiàn)，迄今為止，四環(huán)素類(lèi)藥物已在臨床應(yīng)用中超過(guò)80年。盡管耐藥性問(wèn)題日益突出，但四環(huán)素類(lèi)藥物憑借其獨(dú)特的抗菌譜、抗炎特性及多效性作用，在現(xiàn)代醫(yī)療中仍占據(jù)著不可替代的重要地位。例如多西環(huán)素和米諾環(huán)素。
根據(jù)發(fā)現(xiàn)順序和結(jié)構(gòu)修飾，四環(huán)素類(lèi)藥物可分為三代，第一代為天然抗生素，主要從土壤放線菌中分離而得，包括金霉素，土霉素和四環(huán)素。金霉素最早被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在主要用于獸藥或眼膏。土霉素抗菌活性較弱，除人用外，大多作為水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥物。四環(huán)素是該類(lèi)藥物的原型，曾廣泛應(yīng)用，但耐藥性及藥代動(dòng)力學(xué)特性較差。目前四環(huán)素全身性應(yīng)用已被新一代藥物取代。
第二代四環(huán)素類(lèi)藥物包括多西環(huán)素和米諾環(huán)素。多西環(huán)素又名強(qiáng)力霉素。其口服吸收好，半衰期長(zhǎng)（約18小時(shí)），可每日給藥1-2次。由于并四苯骨架極性非常低，多西環(huán)素脂溶性強(qiáng)，組織穿透力強(qiáng)，尤其在前列腺、肺組織和泌尿生殖道中濃度高。因其優(yōu)異的安全性譜和藥代動(dòng)力學(xué)特性，已成為治療上述組織感染癥的首選。米諾環(huán)素脂溶性極強(qiáng)，組織穿透性極佳，甚至可穿過(guò)血腦屏障。常用于治療痤瘡和某些神經(jīng)系統(tǒng)感染，但前庭毒性相對(duì)較高，不良反應(yīng)為頭暈、眩暈。第三代四環(huán)素藥物如替加環(huán)素。
二、四環(huán)素類(lèi)藥物的配位作用及影響
以強(qiáng)力霉素為例，其配位作用主要發(fā)生于以下兩個(gè)區(qū)域：
1.主配位域，位于A環(huán)C1與C3位點(diǎn)之間的β-二酮系統(tǒng)。在酸性及中性色譜條件下，該結(jié)構(gòu)可發(fā)生烯醇化，形成一個(gè)帶負(fù)電荷的、高度離域的π電子體系，構(gòu)成一個(gè)理想的二齒或三齒配體。
2.輔助配位域，B環(huán)C10位的酚羥基與C11、C12位的羰基可共同構(gòu)成另一個(gè)潛在的金屬結(jié)合位點(diǎn)。
圖1強(qiáng)力霉素分子結(jié)構(gòu)圖
四環(huán)素類(lèi)藥物的核心作用機(jī)制是藥物與細(xì)菌核糖體30S亞基的A位點(diǎn)可逆性結(jié)合。具體來(lái)說(shuō)，藥物與核糖體上Mg2+位點(diǎn)產(chǎn)生配位作用，形成空間位阻，阻止氨酰-tRNA進(jìn)入A位點(diǎn)，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，產(chǎn)生抑菌效應(yīng)（在高濃度下表現(xiàn)為殺菌作用）。
四環(huán)素的配位特性是一把雙刃劍，既使其具有抗菌活性，又帶來(lái)諸多不利因素。首先四環(huán)素類(lèi)藥物與金屬離子的配位作用，導(dǎo)致用藥安全性問(wèn)題非常突出，口服后四環(huán)素類(lèi)藥物可與胃腸道內(nèi)的二價(jià)（Ca2+, Mg2+）和三價(jià)（Al3+, Fe3+）陽(yáng)離子形成不溶性螯合物，嚴(yán)重影響吸收，產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)，常見(jiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、食管潰瘍等。四環(huán)素類(lèi)藥物可與發(fā)育中的牙齒和骨骼中的鈣產(chǎn)生配位作用，導(dǎo)致四環(huán)素牙和骨骼生長(zhǎng)抑制，藥物沉積于牙釉質(zhì)，引起牙齒永久性黃染、棕染（熒光性）和釉質(zhì)發(fā)育不良。藥物沉積于骨骼，則會(huì)暫時(shí)性抑制骨骼生長(zhǎng)。
四環(huán)素的配位特性也嚴(yán)重影響了其分析檢測(cè)。目前大多使用液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)四環(huán)素藥物進(jìn)行分析檢測(cè)。然而，在常規(guī)反相色譜條件下，四環(huán)素類(lèi)化合物常表現(xiàn)出異常的色譜行為，如嚴(yán)重的峰形拖尾，影響定量的準(zhǔn)確性與可靠性。
四環(huán)素類(lèi)化合物色譜行為異常，根源在于其分子對(duì)金屬離子的配位能力?，F(xiàn)代色譜系統(tǒng)，為提高柱效，正逐步使用細(xì)顆粒色譜柱，顯著提高了系統(tǒng)的壓力，不銹鋼流路（柱管、篩板、管路等）是應(yīng)對(duì)高系統(tǒng)壓力的主要技術(shù)手段。
當(dāng)四環(huán)素類(lèi)藥物流經(jīng)色譜柱及管路時(shí)，其A環(huán)的β-二酮系統(tǒng)作為強(qiáng)Lewis堿，與系統(tǒng)內(nèi)暴露的酸性金屬離子產(chǎn)生強(qiáng)烈的配位作用，這種相互作用的強(qiáng)度遠(yuǎn)超反相色譜中的疏水分配作用，且配位平衡動(dòng)力學(xué)過(guò)程緩慢，導(dǎo)致部分分析物分子被暫時(shí)吸附于色譜柱特定活性位點(diǎn)上，在色譜圖上表現(xiàn)為嚴(yán)重的峰拖尾。對(duì)于配位作用更強(qiáng)的化合物，甚至發(fā)生不可逆吸附，導(dǎo)致絕對(duì)回收率下降。另外配位作用也可能造成保留時(shí)間的重現(xiàn)性差，從而影響準(zhǔn)確定性。
配位作用是四環(huán)素類(lèi)藥物發(fā)揮抗菌藥理作用（與核糖體30S亞基上Mg²?結(jié)合）的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。然而，在分析檢測(cè)場(chǎng)景下，此特性成為獲得理想色譜數(shù)據(jù)的核心障礙。
三、如何構(gòu)建惰性色譜分析體系
降低金屬活性表面的影響是解決此問(wèn)題的一個(gè)途徑。因此需要建立一個(gè)涵蓋色譜柱、流動(dòng)相及整個(gè)流路系統(tǒng)的金屬惰性分析體系。
3.1 選取金屬鈍化色譜柱
現(xiàn)代反相色譜柱包括填料和柱體兩部分，填料使用的硅膠顆粒大都采用高純度硅膠合成工藝，極大降低了金屬雜質(zhì)的含量，消除了潛在的配位相互作用位點(diǎn)。但常規(guī)反相色譜柱不會(huì)對(duì)金屬柱體進(jìn)行處理，因此常常存在活性表面?？蛇x擇金屬鈍化色譜柱，此類(lèi)色譜柱對(duì)不銹鋼組件進(jìn)行特殊表面處理，如形成致密的鉻氧化物鈍化層或鍍覆聚合物薄膜，構(gòu)成物理屏障，阻斷分析物與金屬的接觸。
3.2 流動(dòng)相體系的選擇
需選擇合適的流動(dòng)相以抑制次級(jí)相互作用，同時(shí)兼容質(zhì)譜檢測(cè)。
水相宜采用含2-10 mM 甲酸銨和0.1%（v/v）甲酸的水溶液。甲酸提供酸性環(huán)境（pH ≈ 2.5），確保硅醇基與分析物上的堿性基團(tuán)質(zhì)子化，最大限度地抑制離子交換相互作用；甲酸還可提供H+，有助于正離子模式下形成穩(wěn)定的[M+H]?準(zhǔn)分子離子。甲酸銨提供揮發(fā)性緩沖體系，穩(wěn)定pH，保證保留時(shí)間的重現(xiàn)性。
有機(jī)相選擇乙腈，因其具有較低的粘度、較小的離子抑制效應(yīng)及適宜的洗脫強(qiáng)度。
水，甲酸，甲酸銨和乙腈宜選擇質(zhì)譜級(jí)試劑，最大程度減少干擾離子，儲(chǔ)存有機(jī)相的玻璃容器應(yīng)采用的高硼硅玻璃，以減少金屬離子析出。使用PP（聚丙烯）或PET（聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯）材質(zhì)的容器儲(chǔ)存水相流動(dòng)相，最大程度避免金屬離子干擾。
4.實(shí)例：四種四環(huán)素類(lèi)藥物的LC-MS/MS分析
為分析檢測(cè)四環(huán)素，土霉素，金霉素，強(qiáng)力霉素這四種應(yīng)用廣泛的四環(huán)素類(lèi)藥物，建立了強(qiáng)力霉素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。
首先采用金屬表面經(jīng)特殊鈍化處理的雜化顆粒C18色譜柱（2.1 × 100 mm, 1.7 μm），并與未經(jīng)表面特殊處理的雜化顆粒C18色譜柱（3.0× 100 mm, 2.7 μm）進(jìn)行對(duì)比。
流動(dòng)相水相采用含5 mmol/L 甲酸銨的0.1%甲酸水溶液，有機(jī)相則使用乙腈，儲(chǔ)存水相的容器采用PET材質(zhì)的塑料瓶，有機(jī)相則采用Duran玻璃（一種高硼硅玻璃）材質(zhì)的容器儲(chǔ)存。
液相系統(tǒng)中，除高壓區(qū)采用金屬材質(zhì)，低壓區(qū)一律更換為耐高壓PEEK（聚醚醚酮）輸液管，降低金屬對(duì)分析檢測(cè)目標(biāo)物的影響。
梯度洗脫條件如下：0-1 min，水相比例90%，有機(jī)相比例10%，清洗樣液中的極性物質(zhì)；1-9 min，有機(jī)相比例線性增加至90%，完成化合物分離；9-11 min，保持90%有機(jī)相比例2min，洗脫待測(cè)化合物，并對(duì)色譜柱中極性較低的物質(zhì)進(jìn)行清洗；11.01-13 min，將水相比例快速調(diào)整至90%，并保持3 min，充分平衡色譜柱，保證重現(xiàn)性。
質(zhì)譜條件，電噴霧離子源（ESI+）；毛細(xì)管電壓，3.5 KV；RF電壓，2.5 V；萃取電壓，3 V；源溫，150°C；脫溶劑氣溫度，500°C；脫溶劑氣流速：1000 L/Hr；錐孔氣流速，50 L/Hr。
分析方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)表明，采用該策略后，金霉素和強(qiáng)力霉素的色譜行為得到根本性改善，改善了峰拖尾現(xiàn)象，峰對(duì)稱因子達(dá)到0.95-1.05，四環(huán)素和土霉素的峰寬由0.5 min降至0.25 min?？梢宰C實(shí)金屬配位作用得到控制。
圖2 未經(jīng)金屬鈍化處理的C18色譜柱色譜圖
圖3鈍化處理的C18色譜柱色譜圖
連續(xù)進(jìn)樣中，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差優(yōu)于1.5%。由于峰形對(duì)稱，積分更加準(zhǔn)確，線性范圍得到顯著改善。不同濃度水平下的回收率可以滿足定量要求。
5. 總結(jié)
四環(huán)素類(lèi)化合物在色譜分析中的峰形劣化問(wèn)題，其本質(zhì)可能是分析系統(tǒng)活性位點(diǎn)β-二酮系統(tǒng)與金屬的配位作用。有效的解決方案是采用金屬鈍化色譜柱及惰性流路的液相色譜系統(tǒng)。本文實(shí)驗(yàn)部分充分驗(yàn)證了該方案可顯著減輕峰拖尾，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定準(zhǔn)確的定量。
可以推測(cè)，本文的方法具有普適性，可推廣至所有易與金屬發(fā)生配位作用的化合物分析，如核苷酸、磷酸化肽段、兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)等。本文方法為易于和金屬配位的化合物分析提供了有益借鑒。
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