柱層析是世界各地實(shí)驗(yàn)室中最常用的純化技術(shù)。如果做得好，它可以簡單快速地從混合物中分離出所需的化合物。但是，與許多化學(xué)實(shí)踐一樣，快速有效地設(shè)置和運(yùn)行色譜柱可能需要數(shù)年才能掌握。在這里，小編將提供了一些柱層析的小tips和技巧，對柱層析過程中常遇到的一些問題進(jìn)行故障排除并給出替代方案。
Part 01、裝柱準(zhǔn)備
填料準(zhǔn)備
a.根據(jù)需求確定柱體積，通過公式計(jì)算所需填料體積。
通常情況下填料的壓縮因子在1.1-1.18之間，填料出廠時(shí)的膠懸液濃度為50%，建議裝柱時(shí)將膠懸液濃度控制在50%-70%。
b.換液：將填料靜置后待填料與緩沖液充分分層，將上層保護(hù)液傾去，補(bǔ)加適量純化水，重復(fù)兩到三次。
c.除氣/勻漿：可通過勻漿棒上下?lián)v動(dòng)均勻分?jǐn)?shù)填料，同時(shí)達(dá)到一定的除氣作用。注：如有勻漿罐，可借助勻漿罐完成換液、除氣，勻漿工作。
層析柱及層析系統(tǒng)準(zhǔn)備
a.檢查層析柱及層析系統(tǒng)選型是否匹配。
b.使用前對層析柱、層析系統(tǒng)進(jìn)行清洗，檢查層析柱安裝是否水平、密封性是否良好、篩網(wǎng)尺寸是否適用。
Part 02、裝柱流程
手動(dòng)層析柱
1.層析系統(tǒng)及管路排氣。
2.柱底篩網(wǎng)排氣：將柱底連接層析系統(tǒng)，通過下進(jìn)上出沖出底部氣泡，頑固氣泡可通過外接恒流泵吸出。關(guān)閉柱底閥，柱底留1-2cm 純化水。
3.將勻漿好的填料一次性均勻引流進(jìn)入層析柱，靜置一段時(shí)間。
4.柱頂篩網(wǎng)排氣：將柱頭固定至支架上，安裝柱頂四通閥，A口為系統(tǒng)進(jìn)液口，B口為層析柱進(jìn)液口，C口為排廢口。按下圖將流路調(diào)節(jié)至A→B，開啟流速，排盡柱頭氣泡，頑固氣泡可通過外接恒流泵吸出。氣泡排盡后觀察分配盤分液是否均勻，篩網(wǎng)是否緊固。
層析柱四通閥示意圖
5. 待填料沉降至上方出現(xiàn)3-5cm澄清液面后，將柱頭移至層析柱上方，緩慢下落上柱頭至液面下方，注意不要引入氣泡，柱頭及篩網(wǎng)上附著的氣泡可通過輕輕搖晃柱頭去除，如仍有頑固氣泡，可重復(fù)本步驟，直至氣泡消除。
6.擰緊上柱頭密封圈（不宜過緊，密封即可），通過層析系統(tǒng)進(jìn)行低流速壓柱（通常為30-60cm/h），使填料充分沉降，標(biāo)記膠面位置。
7.根據(jù)壓縮系數(shù)計(jì)算最終柱高，將四通閥流路切換為B→C，擰動(dòng)螺桿將柱頭下落至計(jì)算值（下落時(shí)保證密封圈有一定密封性，切勿使填料通過密封圈漏出），最后充分密封膠圈，將四通閥流路切回至A→B。
電動(dòng)層析柱
電動(dòng)層析柱的裝柱流程基本與手動(dòng)層析柱一致，需要注意的是電動(dòng)層析柱的排氣方式受層析柱結(jié)構(gòu)的影響，每個(gè)廠家的設(shè)計(jì)都略有不同，在裝柱前請根據(jù)廠家的指導(dǎo)進(jìn)行排氣操作。
Part 03、干法裝柱與濕法裝柱
裝柱子（添硅膠）時(shí)，常用的有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱，二者各有優(yōu)劣。不論干法還是濕法，硅膠（稱為固定相更為廣義）的上表面一定要平整，并且硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右（長度沒有絕對之說，根據(jù)自身情況而定，制備的大柱可以長達(dá)一米），太短了可能分離效果不好，太長了也會(huì)由于擴(kuò)散或拖尾導(dǎo)致分離效果不好。
濕法裝柱是先把硅膠用適當(dāng)?shù)娜軇┌鑴蚝?，再填入柱子中，然后再加壓（土方法可以用養(yǎng)魚的氧氣泵加壓或是用氮?dú)?，?dāng)然不加壓也可以）用淋洗劑"走柱子"，本法最大的優(yōu)點(diǎn)是一般柱子裝的比較結(jié)實(shí)，沒有氣泡。
干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)（濕法也要敲的，效果好點(diǎn)），至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會(huì)使得柱子裝的很結(jié)實(shí)（一般柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。接著是用淋洗劑"走柱子"，一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。干法裝柱較方便，但最大的缺陷在于"走柱子"時(shí)，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到）（梯度洗脫時(shí)，濕法裝柱也會(huì)出現(xiàn)該情況，比較不好處理，可以緩慢改變?nèi)軇?，且置于通風(fēng)處），容易產(chǎn)生氣泡，這一點(diǎn)在使用低沸點(diǎn)的淋洗劑時(shí)如乙醚（用乙醚最最明顯），二氯甲烷更為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時(shí)候，氣泡就會(huì)釋放出來，嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)柱子變花，樣品不可能平整地通過，當(dāng)然也就談不上分離了。解決的辦法是：
第一、硅膠一定要壓結(jié)實(shí)；
第二、 一定要用較多的溶劑"走柱子"，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。
也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂(我一般墊張濾紙，撒上石英砂，再放些棉花)，防止添加溶劑的時(shí)候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個(gè)必要。
Part 04、干法上樣與濕法上樣
濕法上樣
1.將樣品溶解在最少量的溶劑中（5-10滴）。此處允許使用比洗脫溶劑稍微更極性的溶劑。如果您需要使用二氯甲烷或更強(qiáng)的溶劑，可能優(yōu)選下述干法上樣方法。
2.使用注射器或吸管將樣品直接滴到硅膠的頂部。盡量不要擾動(dòng)硅膠表面，理想情況下，樣品應(yīng)在表面上均勻分布，以便形成薄的水平帶。
3. 添加完整個(gè)樣品后，讓色譜柱排出，使溶劑水平接觸二氧化硅頂部。
4. 使用移液器小心添加更多溶劑，使溶劑水平高于沙子頂部約10mm。
5. 讓這種溶劑排出，直至溶劑水平高于砂子頂部約1-2毫米。
6. 重復(fù)步驟5和6一次或兩次。這將確保您的樣品被吸收到二氧化硅上。
7. 最后，根據(jù)需要添加盡可能多的溶劑，然后就可以開始運(yùn)行列了。
如果您的化合物在溶劑系統(tǒng)中溶解度較差可以將樣品干燥加載到色譜柱上。
干法上樣
1.將樣品溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，并將其轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中。
2.向溶解的樣品中加入干硅膠（約為樣品質(zhì)量的10-20倍）。
3. 輕輕攪拌混勻，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)溶劑，直至二氧化硅干燥且能夠自由流動(dòng)。如果它仍然是油，則需要添加更多的硅膠并重復(fù)該過程。
4. 小心地將溶劑添加到色譜柱中，使溶劑水平高于硅膠頂部2-3厘米。使用移液器確保二氧化硅表面不受干擾。
5. 將干燥后的樣品硅膠倒入色譜柱中，使其沉降。確保溶劑水平始終保持在二氧化硅頂部之上且不存在氣泡。最好的方法是慢慢加入。
6. 按照上述濕法上樣的步驟4-8，將樣品完全吸收到色譜柱上。
收集餾分：
在組分流出之前存在一定的死體積，死體積的大小取決于柱子的大小和分離的化合物，可在色譜柱上標(biāo)記起始溶劑水平和下方對應(yīng)二氧化硅長度的標(biāo)記（圖2）。一旦溶劑水平降至第二個(gè)標(biāo)記以下，就可以開始收集餾分。
圖2.死體積估計(jì)
接液體積
表1. 推薦參數(shù)
故障排除：
表2.柱層析過程中遇到的常見問題及其解決方案
還有些常見的注意事項(xiàng)：層析柱水平校準(zhǔn)；層析柱上下篩網(wǎng)無氣泡，裝柱溶液去氣；膠懸液濃度控制在50%-60%；不要超過填料的最大耐壓，以免對填料造成損壞。最后，總而言之，言而總之，影響裝柱的因素很多，如果填料裝填有一定的困難，小編認(rèn)為最有效的方法還是直接質(zhì)詢廠商，因?yàn)檠b柱方法也包含在廠商開發(fā)此種填料的過程中。
Part 05、柱效檢測
層析柱裝填完成后必須通過柱效測定確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效測定可以采用丙酮或者NaCl作為樣品進(jìn)行測定，按照下表配制樣品和流動(dòng)相。
樣品上樣的方法通常有兩種，當(dāng)層析柱與層析系統(tǒng)較為匹配時(shí)，可通過層析系統(tǒng)直接上樣進(jìn)行檢測。實(shí)際情況中經(jīng)常會(huì)有層析柱過小而層析系統(tǒng)過大的現(xiàn)象發(fā)生，此時(shí)可通過恒流泵進(jìn)行上樣，上樣結(jié)束后繼續(xù)由層析系統(tǒng)進(jìn)行洗脫。具體方法如下：
a.在柱頂四通閥C口接入恒流泵管路，D口接入排廢管。
b.將四通閥流路切換為C→D，通過恒流泵吸取樣品，排盡管路中的空氣。
c.打開新的檢測程序，將四通閥流路切換為C→B，通過恒流泵上樣。
d.將四通閥流路切換為A→B，通過層析系統(tǒng)繼續(xù)洗脫，直至檢測完成。
HETP和As計(jì)算方法
柱效通常用理論塔板
高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jià)。根據(jù)UV或者電導(dǎo)率曲線計(jì)算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數(shù)（N）和非對稱因子（As），公式如下：
HETP=L/NN=5.54(Ve/Wh)2
其中：Ve=保留體積，Wh=半高峰寬，L=柱高N=理論塔板數(shù)，Ve和Wh的單位應(yīng)一致；As=b/a其中：a=在10%峰高處的第一個(gè)半峰寬，b=在10%峰高處的第二個(gè)半峰寬
結(jié)果評價(jià)
一般來說，合格的柱效要求 HETP 的值需小于三倍介質(zhì)平均粒徑，且非對稱因子在 0.8~1.5之間。對于不理想的柱效需要分析原因并重新裝柱。
Part 06、柱效評價(jià)的常見問題及處理
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
