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摘要

藥物反應(yīng)性代謝物是指藥物經(jīng)代謝酶催化形成的反應(yīng)性中間產(chǎn)物，此代謝產(chǎn)物具有親電性，可與DNA或蛋白質(zhì)等生物大分子中的親核基團共價結(jié)合產(chǎn)生毒性。詳細了解藥物反應(yīng)性代謝物的致毒機制和易活化位點在反應(yīng)性代謝物篩查、候選藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計以及降低藥物毒性中具有的重要意義。本文綜述了一些在體內(nèi)或體外檢測到反應(yīng)性代謝物的藥物，按照靶點及產(chǎn)生的反應(yīng)性代謝物類型分類討論了其致毒機制，定位易代謝活化位點，并簡述了檢測反應(yīng)性代謝物的方法。

 

關(guān)鍵詞

反應(yīng)性代謝物; 蛋白質(zhì)共價結(jié)合; DNA共價結(jié)合; 藥物毒性機制; 檢測方法

 

反應(yīng)性代謝物是指藥物經(jīng)代謝酶催化后形成的反應(yīng)性中間產(chǎn)物，通常具有親電性，可與體內(nèi)的親核試劑如谷胱甘肽(glutathione，GSH)，或生物大分子如蛋白質(zhì)和DNA結(jié)合產(chǎn)生毒性反應(yīng)(見圖1)[1]。美國FDA發(fā)布的“藥物性肝損傷(drug-induced-liver injury，DILI)生物標(biāo)志物支持函”中提到反應(yīng)性代謝物是藥物產(chǎn)生肝毒性的機制之一[2]。例如: 很早就報道的對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)可經(jīng)CYP450酶代謝激活為N-乙?；鶎Ρ锦珌啺罚摯x物具有高度的活性，能夠迅速耗盡細胞內(nèi)的GSH，當(dāng)GSH水平下降時，此活性代謝物便能夠與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生共價結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能受損。這是APAP引起嚴重肝損傷的重要原因[3]。許多上市藥物因生物活化為反應(yīng)性代謝物產(chǎn)生各種毒性而被停用或撤市[4]。近些年報道了越來越多的藥物毒性與反應(yīng)性代謝物有關(guān)。本文綜述了一些在體內(nèi)或體外實驗中檢測到反應(yīng)性代謝物的藥物，按照結(jié)合靶點分類討論了其致毒機制，定位了易代謝活化位點，簡述了檢測反應(yīng)性代謝物的方法，有助于藥物反應(yīng)性代謝物致毒機制的研究、降低藥物毒性及提高藥物研發(fā)成功率。

 

1藥物反應(yīng)性代謝物

本文分析了PubMed，Science Direct，SCI-HUB，Crossref和中國知網(wǎng)5個數(shù)據(jù)庫中共67篇文獻/報道，共整理了27個藥物的反應(yīng)性代謝物，見表1。并進一步按照反應(yīng)性代謝物的損傷靶點分為損傷蛋白質(zhì)、損傷DNA這2類進行分類討論。

1.1 產(chǎn)生損傷蛋白質(zhì)的反應(yīng)性代謝物的藥物

藥物反應(yīng)性代謝物主要是親電性物質(zhì)，少部分是自由基，反應(yīng)性代謝物與蛋白質(zhì)結(jié)合是常見的致毒機制，本文中損傷蛋白質(zhì)的藥物占比81%左右，藥物羅列見表1。反應(yīng)性代謝物含有一些相同的警報結(jié)構(gòu)，如苯醌、亞胺、環(huán)氧、酰基葡萄糖醛酸苷等，并按照結(jié)構(gòu)進行分類討論。親電性反應(yīng)性代謝物常與蛋白質(zhì)中的親核基團，如半胱氨酸、酪氨酸和絲氨酸等以共價結(jié)合的形式結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能異常[1，57]，自由基產(chǎn)生的活性氧過量可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，可能會使蛋白質(zhì)氧化損傷[8]。

1.1.1 產(chǎn)生苯醌亞胺類反應(yīng)性代謝物的藥物

藥物結(jié)構(gòu)中含有苯酚、對苯二酚或兒茶酚和含N化合物等結(jié)構(gòu)的藥物易經(jīng)代謝產(chǎn)生苯醌亞胺類代謝產(chǎn)物。苯醌亞胺結(jié)構(gòu)具有α，β-不飽和性，作為Michael受體可以與蛋白質(zhì)中的親核基團(如巰基、氨基和羥基)發(fā)生Michael加成反應(yīng)，形成共價鍵。這種共價結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響細胞的正常生理功能[58]。有些藥物在體內(nèi)代謝產(chǎn)生具有苯醌亞胺結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性代謝物，而有些藥物反應(yīng)性代謝物單獨具有苯醌或亞胺結(jié)構(gòu)。

1.1.1.1 雙氯芬酸

雙氯芬酸經(jīng)CYP2C9催化生成雙氯芬酸-1'，4'-苯醌亞胺，也可在CYP3A4的作用下先羥基化為5-羥基雙氯芬酸，隨后由CYP2C9催化產(chǎn)生雙氯芬酸-2，5-苯醌亞胺，這些苯醌亞胺類反應(yīng)性代謝物作為Michael受體與蛋白質(zhì)共價結(jié)合(見圖2)，產(chǎn)生藥物性肝損傷及胃腸毒性[5-6]。

1.1.1.2 卡馬西平

卡馬西平在體內(nèi)被CYP450氧化生成2-羥基-卡馬西平，2-羥基-卡馬西平在失去異氰酸酯的情況下可進一步氧化成活性苯醌亞胺類反應(yīng)性代謝物，其可與蛋白質(zhì)硫醇基團(半胱氨酸)反應(yīng)或被還原為2-羥基亞氨基二苯乙烯(見圖3)，前者會導(dǎo)致肝腎毒性的產(chǎn)生，后者可以激活炎癥小體[8-9]。炎癥小體的激活可能會激活免疫系統(tǒng)，這可能會導(dǎo)致某些患者發(fā)生過敏反應(yīng)[9]。

1.1.1.3 吉非替尼

吉非替尼的嗎啉基團經(jīng)CYP3A4代謝活化產(chǎn)生2種苯醌亞胺和1種亞胺，這些反應(yīng)性代謝物中的苯醌或亞胺結(jié)構(gòu)可與蛋白質(zhì)中的親核基團共價結(jié)合，這可能與吉非替尼的肝毒性有關(guān)(見圖4)[10-11]。還有研究表明吉非替尼-苯醌亞胺2可以引起肝細胞釋放損傷相關(guān)的分子模式，激活炎性小體，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫相關(guān)的不良事件[12]。

1.1.1.4 曲唑酮

曲唑酮中的3-氯苯基哌嗪環(huán)還可以經(jīng)CYP3A4催化產(chǎn)生對羥基曲唑酮和間氯苯基哌嗪，前者經(jīng)氧化可能產(chǎn)生親電性的苯醌亞胺[14]，后者在CYP2D6作用下也可產(chǎn)生苯醌亞胺類反應(yīng)性代謝物[15]。這些代謝物具有與蛋白質(zhì)中親核基團共價結(jié)合導(dǎo)致毒性的潛力。

1.1.1.5 阿莫地喹

阿莫地喹進入體內(nèi)后的主要代謝物是由CYP2C8催化產(chǎn)生的N-脫乙基阿莫地喹[16]。此代謝物由CYP3A4，CYP2D6，CYP2C8和CYP2C9進一步催化產(chǎn)生N-脫乙基阿莫地喹-苯醌亞胺[17-18]。阿莫地喹在體內(nèi)也可直接在CYP3A4，CYP2D6，CYP2C8的催化下產(chǎn)生阿莫地喹-苯醌亞胺[18]。這2種反應(yīng)性代謝物中的親電性苯醌亞胺結(jié)構(gòu)均可在體內(nèi)與蛋白質(zhì)的硫醇基團(半胱氨酸)共價結(jié)合(見圖5)[16]，這是產(chǎn)生毒性的重要原因之一。

1.1.1.6 羅美昔布

羅美昔布在體內(nèi)經(jīng)CYP450催化主要的代謝物為4-羥基羅美昔布，又在CYP450的作用下主要代謝活化為苯醌亞胺，苯醌亞胺與GSH結(jié)合導(dǎo)致GSH耗竭后與蛋白質(zhì)結(jié)合是羅美昔布致肝損傷的機制之一[19-20]。

1.1.1.7 拉帕替尼

拉帕替尼在體內(nèi)通過CYP3A4和CYP3A5作用進行C-羥基化產(chǎn)生反應(yīng)性苯醌亞胺，此親電性反應(yīng)性代謝物可能會共價修飾蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細胞應(yīng)激和/或免疫激活，是拉帕替尼產(chǎn)生肝毒性的重要原因[22]。

1.1.1.8 萘法唑酮

在羥基親核試劑存在下，奈法唑酮與微粒體或重組CYP3A4孵育后，其結(jié)構(gòu)中的3-氯苯基哌嗪環(huán)上發(fā)生了羥基化和巰基共軛反應(yīng)，先生成對羥基奈法唑酮，然后將其兩電子氧化為反應(yīng)性苯醌亞胺中間產(chǎn)物[23-24]。此外，萘法唑酮N-脫芳基的副產(chǎn)物是2-氯-1，4-苯醌[23]，這些結(jié)構(gòu)具有高親電性，常與蛋白質(zhì)共價結(jié)合致肝毒性(見圖6)。

1.1.1.9 阿派立唑

阿派立唑結(jié)構(gòu)中含有芳基哌嗪基和乙酰苯胺基團，前者經(jīng)CYP3A4介導(dǎo)羥基化后產(chǎn)生對羥基阿立哌唑代謝物，并進一步活化為苯醌亞胺，后者鄰位或?qū)ξ环枷阕辶u基化，然后氧化成苯醌亞胺[24]。此外，阿立哌唑中的哌嗪環(huán)可以進行α-碳氧化，形成反應(yīng)性的亞胺離子中間產(chǎn)物[24]。這些反應(yīng)性代謝物均具有與蛋白質(zhì)共價結(jié)合產(chǎn)生毒性的潛力。

1.1.1.10 帕羅西汀

帕羅西汀在CYP2D6的催化下氧化產(chǎn)生帕羅西汀-兒茶酚，隨后氧化產(chǎn)生鄰苯醌[26]?；钚怎惔x物可與蛋白質(zhì)共價結(jié)合致各種毒性，解毒途徑是與GSH或S-腺苷蛋氨酸的親核取代[58]。

1.1.1.11 雷洛昔芬

雷洛昔芬的苯并噻吩結(jié)構(gòu)由CYP3A4催化氧化為7-羥基雷洛昔芬，其可進一步被催化產(chǎn)生雷洛昔芬-6，7-鄰苯醌，此代謝物是CYP450的抑制劑[27-28]。雷洛昔芬也可以經(jīng)CYP3A4催化直接產(chǎn)生苯醌類代謝物[29]。這些具有親電活性和氧化還原活性的醌類代謝物可與蛋白質(zhì)共價結(jié)合(見圖7)，這可能是雷洛昔芬產(chǎn)生細胞毒性的原因[30]。

1.1.1.12 諾米芬辛

諾米芬辛的苯胺結(jié)構(gòu)在CYP450作用下氧化形成對苯醌類代謝物[31]，反應(yīng)性苯醌類代謝物能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生共價結(jié)合，形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-代謝物加合物，從而引發(fā)一系列的毒性反應(yīng)。

1.1.1.13 塞卡替尼

塞卡替尼的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有N-甲基哌嗪基團和亞甲二氧基苯基團，在CYP3A4催化作用下，前者生物活化形成亞胺中間產(chǎn)物，后者代謝活化為鄰苯醌中間產(chǎn)物(見圖8)[32-33]。反應(yīng)性苯醌和亞胺代謝物具有與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的潛力，這可能是導(dǎo)致塞卡替尼中毒的主要原因。

1.1.1.14 酒石酸美托洛爾

酒石酸美托洛爾的氨基丙醇側(cè)鏈的間位在體內(nèi)經(jīng)CYP450作用羥化生成苯酚代謝物，此代謝物被氧化為反應(yīng)性鄰亞甲基苯醌，鄰亞甲基苯醌是一種親電物質(zhì)，可與蛋白質(zhì)共價結(jié)合，這可能與酒石酸美托洛爾的肝毒性有關(guān)[34]。

1.1.1.15 坦度替尼

坦度替尼結(jié)構(gòu)中含有哌啶環(huán)和哌嗪環(huán)，哌啶環(huán)和哌嗪環(huán)經(jīng)CYP450作用羥化后脫水生成亞胺代謝產(chǎn)物(見圖9)，這些產(chǎn)物與蛋白質(zhì)共價結(jié)合被預(yù)測為坦度替尼產(chǎn)生毒性的原因[35]。

1.1.2 產(chǎn)生環(huán)氧化物類反應(yīng)性代謝物的藥物

烯烴類化合物可以形成相應(yīng)的環(huán)氧化物，而環(huán)氧具有高反應(yīng)性，易開環(huán)并與蛋白質(zhì)中的親核基團共價結(jié)合，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[59]，這是能產(chǎn)生此類代謝物的藥物產(chǎn)生毒性的主要原因之一。

1.1.2.1 卡馬西平

卡馬西平含有烯烴結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)可被CYP450氧化生成10，11-環(huán)氧化物，其可與蛋白質(zhì)共價結(jié)合致毒副反應(yīng)(見圖10)[9]。

1.1.2.2 苯溴馬隆

苯溴馬隆結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)可先經(jīng)過生物活化形成烯類化合物，烯烴結(jié)構(gòu)經(jīng)CYP3A介導(dǎo)代謝激活產(chǎn)生環(huán)氧化物，該環(huán)氧化物與蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基共價結(jié)合(見圖11)，這是苯溴馬隆誘導(dǎo)的肝毒性的原因[36-37]。

1.1.2.3 阿派立唑

阿派立唑經(jīng)CYP3A4催化產(chǎn)生脫氫阿派立唑，這是一種α，β-不飽和羰基化合物，易在雙鍵上發(fā)生氧化，形成可與還原型谷胱甘肽反應(yīng)的親電環(huán)氧化物[25]。

1.1.2.4 拉莫三嗪

拉莫三嗪由CYP2A6催化可以代謝活化為活性環(huán)氧芳烴中間產(chǎn)物，鄰二氯苯基部分是活化的潛在部位，此環(huán)氧類反應(yīng)性代謝物具有與蛋白質(zhì)共價結(jié)合致毒的潛力[38-39]。

1.1.2.5 曲唑酮

曲唑酮中的烯烴結(jié)構(gòu)在CYP3A4的作用下氧化為親電性的環(huán)氧化物，此氧化產(chǎn)物可消耗GSH，也可與蛋白質(zhì)的親核基團共價結(jié)合產(chǎn)生毒性[14]。

1.1.3 產(chǎn)生?；咸烟侨┧彳疹惙磻?yīng)性代謝物的藥物

如果藥物結(jié)構(gòu)中包含羧酸、醇羥基等可能與葡萄糖醛酸結(jié)合的位點，就可能活化為?；咸烟侨┧彳?，?；咸烟侨┧彳臻_環(huán)形成鏈狀醛基結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可與蛋白質(zhì)氨基酸殘基結(jié)構(gòu)中的NH2形成亞胺結(jié)構(gòu)并重排形成穩(wěn)定的蛋白加合物，誘發(fā)毒性反應(yīng)的發(fā)生。這是能產(chǎn)生此類代謝物的藥物產(chǎn)生毒性的主要原因之一。

1.1.3.1 MK-8666

MK-8666結(jié)構(gòu)中的羧酸可在體內(nèi)經(jīng)二磷酸尿苷葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate glucuronic acid transferase，UGT)催化產(chǎn)生?；咸烟侨┧彳疹惔x物，此代謝物重排為開環(huán)醛，進一步與蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基共價結(jié)合(見圖12)，這是MK-8666產(chǎn)生肝損傷的機制[40]。

1.1.3.2 丙戊酸

丙戊酸在CYP450作用下產(chǎn)生4烯-丙戊酸，并進一步代謝為2，4-二烯-丙戊酸，丙戊酸和2，4-二烯-丙戊酸中都含有羧酸結(jié)構(gòu)，前者結(jié)構(gòu)中的羧酸可經(jīng)葡萄糖醛酸化反應(yīng)生成丙戊酸?；咸擒账幔隗w外可抑制微管蛋白組裝并與微管蛋白共價結(jié)合，這可能與丙戊酸具有神經(jīng)管毒性有關(guān)[43]，后者結(jié)構(gòu)中的羧酸結(jié)構(gòu)活化為可與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的?；咸烟侨┧彳疹惙磻?yīng)性代謝物(見圖13)，這可能是丙戊酸具有肝臟毒性和致畸的原因[41-42]。

1.1.3.3 羅美昔布

羅美昔布在體內(nèi)經(jīng)CYP450催化代謝為4-羥基羅美昔布，此代謝物與羅美昔布原型藥中都含有羧酸結(jié)構(gòu)，經(jīng)葡萄糖醛酸化均可生成?；咸烟侨┧彳疹惙磻?yīng)性代謝物(羅美昔布-1O-?；咸烟侨┧彳蘸?'-羥基-羅美昔布-1-O-?；咸烟侨┧彳?，這2種物質(zhì)都易與GSH通過轉(zhuǎn)酰化反應(yīng)生成藥物-S-?；?GSH加合物[21]，耗竭GSH后與蛋白質(zhì)共價結(jié)合導(dǎo)致嚴重的肝損傷。

1.1.3.4 雙氯芬酸

雙氯芬酸中含羧基結(jié)構(gòu)，可以在體內(nèi)由UGT催化下代謝活化產(chǎn)生雙氯芬酸?；?D-葡萄糖醛酸苷，參與肝蛋白修飾，產(chǎn)生藥物性肝損傷[5，7]。

1.1.4 其他

除了上述幾種常見的致毒反應(yīng)性代謝物警戒結(jié)構(gòu)，還有其他損傷蛋白質(zhì)的反應(yīng)性代謝物類型，如亞硝基、自由基和親電陽離子等結(jié)構(gòu)也具有損傷蛋白質(zhì)產(chǎn)生各種毒性的潛力。

1.1.4.1 白消安

白消安在體內(nèi)與谷胱甘肽結(jié)合，在谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶α1(glutathione S-transferaseα1，GSTA1)的作用下分子內(nèi)重排成谷氨酰甘氨酸類似物γ-谷氨酰-脫氫丙氨基-甘氨酸(γ-glutamylde-hydroalanylglycine，EdAG)[44]。EdAG結(jié)構(gòu)上是GSH的脫氫丙氨酸類似物，含有α，β-不飽和鍵，其高親電性使它可以與蛋白質(zhì)的親核基團反應(yīng)，特別是與谷氧還蛋白等具有GSH結(jié)合位點的蛋白質(zhì)反應(yīng)并破壞其生物學(xué)功能[44-45]，這可能是白消安具有細胞毒性的原因。

1.1.4.2 MK-8666

MK-8666由?；o酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase，ACS)催化產(chǎn)生酰基輔酶A硫酯類代謝物[40]。?；o酶A硫酯具有親電羰基碳，且能夠與生物親核試劑進行非酶催化的轉(zhuǎn)酰反應(yīng)，導(dǎo)致與蛋白質(zhì)的共價結(jié)合和藥物-蛋白質(zhì)加合物的形成[60]。MK-8666產(chǎn)生的?；o酶A硫酯類反應(yīng)性代謝物可與蛋白質(zhì)中賴氨酸、絲氨酸或半胱氨酸共價結(jié)合(見圖14)，這可能是藥物性肝損傷的致病機制[40]。

1.1.4.3 艾德拉尼

艾德拉尼在肝臟中的主要代謝物是氧化代謝產(chǎn)物，此代謝物被鑒定為一種CYP3A抑制劑，CYP3A抑制劑通常會產(chǎn)生反應(yīng)性代謝產(chǎn)物，以共價修飾細胞色素蛋白或血紅素部分[46-47]，這可能就是艾德拉尼引起肝臟毒性的原因。

1.1.4.4 卡馬西平

卡馬西平在體內(nèi)經(jīng)髓過氧化物酶催化產(chǎn)生2-羥基-卡馬西平和3-羥基-卡馬西平，隨后在N-乙酰酪氨酸的存在下產(chǎn)生自由基，自由基常會產(chǎn)生活性氧，若自由基產(chǎn)生過量可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，可能會產(chǎn)生蛋白質(zhì)氧化損傷[8]。

1.1.4.5 3-n-丁基苯酞

3-n-丁基苯酞首先被氧化為3-羥基-(3-n-丁基苯酞)，并在磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfo-transferase，SULT)的作用下進一步進行磺化形成3-羥基-(3-n-丁基苯酞)硫酸鹽，硫酸鹽會自發(fā)分離，產(chǎn)生高活性的親電陽離子(見圖15)，這些親電陽離子具有高度親電性，易通過親電取代反應(yīng)與肝細胞蛋白氨基酸殘基共價結(jié)合產(chǎn)生肝毒性[48]。

1.1.4.6 吉非替尼

吉非替尼的嗎啉基團經(jīng)CYP3A4代謝活化產(chǎn)生2種醛類代謝物，此類醛類反應(yīng)性代謝物屬于硬親電體，具有與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的潛力，這可能與吉非替尼的肝毒性有關(guān)[10-11]。

1.1.4.7 諾米芬辛

諾米芬辛含有苯胺結(jié)構(gòu)，苯胺在CYP2B6催化下的生物活化涉及伯胺氮的N-羥基化，形成N-羥胺中間產(chǎn)物[27，31]。N-羥胺中的羥基(-COOH)和氨基(-NH2)是主要的活性官能團。羥基可以與蛋白質(zhì)中的羧基或氨基發(fā)生酯化或酰胺化反應(yīng)，形成共價鍵。

1.2 產(chǎn)生損傷DNA的反應(yīng)性代謝物的藥物

反應(yīng)性代謝物損傷DNA也是藥物常見的致毒機制，本文中損傷DNA的藥物占比19%，藥物羅列見表1。損傷DNA的藥物反應(yīng)性代謝物常見的是苯醌類、自由基等。

1.2.1 地昔帕明、氯丙咪嗪

在辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和H2O2存在下，地昔帕明和氯丙咪嗪都形成了較寬的紫外吸收光譜，表明氧化反應(yīng)生成了具有損傷DNA潛力的自由基陽離子活性中間產(chǎn)物[50]。使用小牛胸腺DNA和瓊脂糖凝膠電泳法檢測了地昔帕明和氯丙咪嗪的潛在DNA損傷，結(jié)果表明在HRP/H2O2存在下，地昔帕明和氯丙咪嗪的反應(yīng)性代謝物均能降解DNA[50]。

1.2.2 阿霉素

阿霉素可導(dǎo)致DNA斷裂并形成雙鏈斷裂，導(dǎo)致細胞死亡[51]。阿霉素與DNA的虛擬交聯(lián)如圖16B所示，阿霉素的一條鏈上以源自甲醛的亞甲基在鳥嘌呤N2氨基處共價結(jié)合DNA，在另一條鏈上通過2個氫鍵非共價結(jié)合在DNA的鳥嘌呤上[51]。此外，阿霉素及其還原產(chǎn)生的半醌也可使DNA烷化[52](見圖16A)。

1.2.3 氯霉素

使用分離的DNA檢測氯霉素及其代謝產(chǎn)物亞硝基-氯霉素和N-羥基氯霉素對DNA的損傷機制。發(fā)現(xiàn)N-羥基氯霉素可自氧化為氫氮氧化物自由基，并進一步自氧化為亞硝基形式，同時生成超氧自由基陰離子(O2·-)，部分O2·-發(fā)生突變生成H2O2，剩余的O2·-被自氧化成O2，同時Cu(II)被還原成Cu(I)，Cu(I)與H2O2參與了DNA的損傷[53](見圖17)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)的加入有效地增強了N-羥基氯霉素對DNA的氧化損傷[53]。

1.2.4 他莫昔芬

他莫昔芬在體內(nèi)的代謝與多種酶相關(guān)。經(jīng)CYP3A4，CYP1A1，CYP2D6代謝產(chǎn)生α-羥基-二甲2418中基他莫昔芬酯; 經(jīng)CYP3A4代謝產(chǎn)生α-羥基他莫昔芬酯; 經(jīng)CYP3A4，CYP2B6，CYP2C19代謝產(chǎn)生4-羥基他莫昔芬-苯醌，這3種代謝物都具有較高的親電性，可與DNA中的堿基如鳥嘌呤通過親電取代反應(yīng)共價結(jié)合(見圖18)，這種結(jié)合可能會損傷DNA，從而導(dǎo)致細胞功能障礙和細胞死亡，這與子宮內(nèi)膜的變化及致癌相關(guān)[54-56]。

2檢測反應(yīng)性代謝物的方法

由于反應(yīng)性代謝物不穩(wěn)定，不易被檢測到，所以常用親核性試劑作為捕獲劑，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)來檢測反應(yīng)性代謝物。

2.1 捕獲劑

常用的捕獲劑是GSH、GSH衍生物、KCN、甲氧胺或N-乙酰半胱氨酸等，見表2。其中軟親電體(如環(huán)氧化物、苯醌、苯醌亞胺等)可與軟親核試劑(如谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸)結(jié)合來捕獲，而氰化物和甲氧胺等硬親核試劑常用來捕獲硬親電體(如亞胺和醛類化合物等)[61]。

2.2 檢測技術(shù)

檢測反應(yīng)性代謝物的技術(shù)一般使用HPLC-MS/MS技術(shù)，現(xiàn)在常用的串聯(lián)質(zhì)譜儀是三重四級桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀(quadrupole-linear ion trapmass spectrometry，Q-Trap)、四級桿飛行時間質(zhì)譜儀(qua-drupole-time-of-flight mass spectrometry，Q-TOF)及線性離子阱軌道阱組合式質(zhì)譜儀(linear trapquadru-pole-Orbitrap-mass spectrometry，LTQ-Orbitrap)等，結(jié)合輔助技術(shù)(質(zhì)量虧損過濾技術(shù)、背景扣除法以及Mass-MetaSite軟件等)可進一步提高檢測能力，也更便于數(shù)據(jù)的處理和分析[1，62，64-66](見表3)。質(zhì)量虧損過濾技術(shù)屬于數(shù)據(jù)后處理技術(shù)，原理是利用了代謝物與原形藥物具有相近的質(zhì)量虧損[64]; 背景扣除技術(shù)也是數(shù)據(jù)處理技術(shù)，可識別和去除質(zhì)譜信號中的背景噪聲[64]; Mass-MetaSite軟件用于對使用Q-TOF質(zhì)譜儀產(chǎn)生的非靶向精確質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行采集后分析[62]。另外，用HPLC-MS/MS檢測結(jié)構(gòu)重排的GSH結(jié)合物易產(chǎn)生假陰性結(jié)果，若結(jié)合紫外光譜法(ultraviolet  spectrum，UV)或核磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)可降低假陰性概率[62]。

 

3結(jié)語

本文以結(jié)合靶點為分類，綜述了27個藥物在體內(nèi)代謝產(chǎn)生反應(yīng)性代謝物的過程，并對可能的致毒機制進行了詳細介紹，定位易代謝活化位點，簡述了檢測反應(yīng)性代謝物的方法，有助于藥物反應(yīng)性代謝物致毒機制研究、降低藥物毒性和提高藥物研發(fā)成功率。

除了藥物能產(chǎn)生本文中綜述的警報結(jié)構(gòu)反應(yīng)性代謝物，日常接觸到的化學(xué)物質(zhì)也可能具有這種風(fēng)險。例如: 存在于香煙煙霧和汽車尾氣中的苯可以產(chǎn)生環(huán)氧化物、鄰苯醌和對苯醌等反應(yīng)性代謝物，與蛋白質(zhì)共價結(jié)合對骨髓造成損傷，屬于人類環(huán)境致癌物[58]。評估藥物或其他化合物及其反應(yīng)性代謝產(chǎn)物的特異質(zhì)不良反應(yīng)的潛在風(fēng)險仍然是我們面臨的一項重大挑戰(zhàn)。目前在制藥行業(yè)內(nèi)已經(jīng)有了完善的穩(wěn)定代謝物風(fēng)險評估策略，但對反應(yīng)性代謝物風(fēng)險評估策略仍沒有達成共識。有前途的發(fā)展領(lǐng)域之一是體外微生理系統(tǒng)，用于檢測反應(yīng)性代謝物，有助于風(fēng)險評估及毒性機制研究，但缺點是體外微生理系統(tǒng)很難模擬復(fù)雜的人體免疫系統(tǒng)功能[67]。

總之，近些年關(guān)于反應(yīng)性代謝物的警報結(jié)構(gòu)有較多的研究，反應(yīng)性代謝物的檢測方法以及毒性機制研究方面也取得了很大的進展，但是候選藥的反應(yīng)性代謝物風(fēng)險評估也是應(yīng)該關(guān)注的重點之一，制備一套高效可行的藥物反應(yīng)性代謝物風(fēng)險評估策略，雖不能完全消除藥物反應(yīng)性代謝物毒性的影響，但可以盡量減少影響，還可以很大程度上減少資源的浪費。