微生物限度檢查法是評(píng)估非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的關(guān)鍵方法，其檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌、霉菌及酵母菌的數(shù)量測(cè)定以及控制菌的檢查。本文根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2025年版進(jìn)行修訂，修訂內(nèi)容主要涉及陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)、計(jì)數(shù)結(jié)果報(bào)告規(guī)則、沙門菌培養(yǎng)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)、以及中美藥典相關(guān)檢查法的差異比較等方面。
微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。
pH7.0 緩沖液：指pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。
1. 儀器設(shè)備和試劑
1.1 儀器設(shè)備
微生物過濾裝置、生物安全柜、培養(yǎng)箱、移液器、電子天平、恒溫水浴鍋、菌落計(jì)數(shù)器、培養(yǎng)皿、具塞試管、玻璃瓶、三角燒瓶等。
1.2 試劑
胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、沙門增菌液體培養(yǎng)基（RV）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（EE）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（VRBG）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MCA）、麥康凱液體培養(yǎng)基（MCB）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基（CA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（MSA）、梭菌增菌培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）、pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、pH7.2磷酸鹽緩沖液等。
2.環(huán)境要求
微生物限度檢查應(yīng)在不低于D級(jí)背景下的生物安全柜或B級(jí)潔凈區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。
3.操作規(guī)程
3.1 試驗(yàn)的準(zhǔn)備
3.1.1 試劑及培養(yǎng)基的配制
胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、沙門增菌液體培養(yǎng)基（RV）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（EE）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（VRBG）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MCA）、麥康凱液體培養(yǎng)基（MCB）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基（CA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（MSA）、梭菌增菌培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）、pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、pH7.2磷酸鹽緩沖液，均按照商品說明書進(jìn)行配制、分裝與滅菌。
培養(yǎng)基的適用性檢查應(yīng)參照《微生物室培養(yǎng)基管理規(guī)程》執(zhí)行。
備注：如無(wú)特殊說明，所有試劑均需使用純化水或去離子水進(jìn)行配制。
3.1.2 菌液制備及使用
實(shí)驗(yàn)中使用的菌液制備應(yīng)參考《微生物菌種管理規(guī)程》，亦可使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。
3.2 計(jì)數(shù)方法
微生物計(jì)數(shù)方法主要包括平皿法和薄膜過濾法。供試品檢查時(shí)，應(yīng)根據(jù)供試品的理化特性、微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇適宜的計(jì)數(shù)方法，所選方法的適用性必須經(jīng)過確認(rèn)，且檢測(cè)樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果足以判斷供試品是否符合規(guī)定。
3.3 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)
當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變并可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。
3.3.1 供試液制備
水溶性供試品，取供試品，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）溶解或稀釋制成1：10的供試液。若需要，可調(diào)節(jié)供試液pH值至6～8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步進(jìn)行10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。
3.3.2 接種和稀釋
按表1及下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備用于微生物回收試驗(yàn)的供試液。所加菌液的體積不得超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。
表2耐膽鹽格蘭陰性菌的可能菌數(shù)N
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各供試品量檢出結(jié)果
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耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)N
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0.1g或0.1ml
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0.01g或0.01ml
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0.001g或0.001ml
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（cfu/g或ml）
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+
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+
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+
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N＞103
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+
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+
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-
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102<N<103
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+
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-
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-
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10<N<102
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-
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-
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-
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N<10
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（1）實(shí)驗(yàn)組：取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。
（2）供試品對(duì)照組：取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，同實(shí)驗(yàn)組操作。
（3）菌液對(duì)照組：取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按實(shí)驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。
（4）若因供試品抗菌活性或溶解性較差等原因?qū)е聼o(wú)法選擇最低稀釋級(jí)供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用無(wú)法以其他方法消除，供試液可經(jīng)中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。
3.3.3 供試品中微生物的回收
微生物的回收可采用平皿法或薄膜過濾法。
（1）平皿法：包括傾注法和涂布法。
傾注法：取照上述“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液1ml，置直徑90mm的無(wú)菌平皿中，注入15~20ml溫度不超過45℃的熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。
涂布法：取15~20ml溫度不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm的無(wú)菌平皿，待凝固。每一平板表面接種上述照“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。
（2）薄膜過濾法
薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑一般為50mm，若采用其他規(guī)格，應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對(duì)微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。
水溶性供試液過濾前，可先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。
供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗量不得超過500ml，最多不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。
取照上述“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液適量（一般相當(dāng)于1g、1ml或10cm²的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。
若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。
3.3.4 結(jié)果判斷
在計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5~2范圍內(nèi)。
若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，則可按照所采用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。
若方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)時(shí)，采用上述方法仍存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么應(yīng)選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行該供試品的檢查。
3.4 供試品檢查法
3.4.1 檢查量
檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或cm²）。
（1）一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。
（2）除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；膜劑為100cm²；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品。
3.4.2 供試品的檢查
按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。
陰性對(duì)照試驗(yàn)：以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。
3.4.3 平皿法
平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，選取定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。
（1）培養(yǎng)和計(jì)數(shù)：除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在30~35℃培養(yǎng)3~5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20~25℃培養(yǎng)5~7天，觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)，計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。
點(diǎn)計(jì)菌落后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均值不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。
（2）菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于250cfu的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于50cfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。取最高平均菌落數(shù)，計(jì)算1g、1ml或10cm²供試品中所含的微生物數(shù)，取2位有效數(shù)字報(bào)告。
如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以“＜1”乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。
3.4.4 薄膜過濾法
除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于1g、1ml或10cm²供試品的供試液，若供試品所含菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
（1）培養(yǎng)和計(jì)數(shù)：培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法。
（2）菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：以相當(dāng)于1g、1ml或10cm²供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)。若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以“＜1”報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm²供試品），或“＜1”乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。
3.4.5 結(jié)果判斷
（1）需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。
（2）若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。
3.5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)及供試品檢查
供試品控制菌檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。同時(shí)，供試品的控制菌檢查方法也應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確定所采用的方法適用于該產(chǎn)品的控制菌檢查。若檢查程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢查結(jié)果時(shí)，控制菌檢查方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。
供試液制備按3.5.4“供試品檢查”中的規(guī)定或參照3.3.1項(xiàng)進(jìn)行。
3.5.1 試驗(yàn)菌
根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)的試驗(yàn)菌株。確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí)，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。
3.5.2 適用性試驗(yàn)
按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗(yàn)菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中；采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌，過濾后，注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依據(jù)相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗(yàn)菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。
3.5.3 結(jié)果判斷
上述試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，可按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。
3.5.4 供試品檢查
供試品的控制菌檢查應(yīng)按照經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行。
陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)基于質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理的要求，根據(jù)產(chǎn)品特性、方法適用性試驗(yàn)結(jié)果、人員技能與經(jīng)驗(yàn)、數(shù)據(jù)可靠性、污染控制措施和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制水平等因素，綜合評(píng)估確定日常檢驗(yàn)過程中陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的必要性、頻次及其他要求。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查，對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。
陰性對(duì)照試驗(yàn)：以稀釋劑代替供試液，照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。
3.5.5 耐膽鹽革蘭陰性菌
供試液制備和預(yù)培養(yǎng)：取供試品，參考3.3.1的內(nèi)容制成1：10供試液，混勻，在20~25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)使供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不繁殖（約2小時(shí)，不大于5小時(shí)）。
定性試驗(yàn)：除另有規(guī)定外，取相當(dāng)于1g或1ml供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)24~48小時(shí)后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。如果平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。
定量試驗(yàn)：取相當(dāng)于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml和0.001ml）供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)24~48小時(shí)。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。
結(jié)果判斷：若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，則對(duì)應(yīng)培養(yǎng)管判為陽(yáng)性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管的檢查結(jié)果，從表2查得1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。
3.5.6 大腸埃希菌
供試液制備和增菌培養(yǎng)：取供試品，照3.3.1內(nèi)容制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1ml、1貼或10cm²供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。
選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42~44℃培養(yǎng)24~48小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)18~72小時(shí)。
結(jié)果判斷：若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。
3.5.7 沙門菌
供試液制備和增菌培養(yǎng)：取10g或10ml供試品直接處理后接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。
選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物0.1ml接種至10ml RV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。取少量RV沙門增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)18~48小時(shí)。
沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)良好，菌落為淡紅色或無(wú)色、透明或半透明、中心有或無(wú)黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18~24小時(shí)，或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。
結(jié)果判斷：若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長(zhǎng)，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色或黑色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。
3.5.8 銅綠假單胞菌
（1）供試液制備和增菌培養(yǎng)：取供試品，照3.3.3.1的內(nèi)容，制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1ml、1貼或10cm²供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。
（2）選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)18~72小時(shí)。取上述平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。
（3）氧化酶試驗(yàn)：將潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無(wú)菌玻璃棒取上述平板上生長(zhǎng)的菌落涂于濾紙片上，滴加新配置的1%二鹽酸N,N-二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。
（4）結(jié)果判斷：若溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，且氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。
3.5.9 金黃色葡萄球菌
（1）供試液制備和增菌培養(yǎng)：取供試品，照3.3.1的內(nèi)容，制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1ml、1貼或10cm²供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。
（2）選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)18~72小時(shí)。
（3）結(jié)果判斷：若甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長(zhǎng)，或雖有相符或疑似的菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。
3.5.10 梭菌
（1）供試液制備和熱處理：取供試品，照3.3.1的內(nèi)容制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1ml、1貼或10cm²供試品的供試液2份，其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。
（2）增菌、選擇和分離培養(yǎng)：將上述2份供試液分別接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的梭菌增菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件下30~35℃培養(yǎng)48小時(shí)。取上述每一培養(yǎng)物少量，分別涂抹接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下30~35℃培養(yǎng)48~72小時(shí)。
（3）過氧化氫酶試驗(yàn)：取上述平板上生長(zhǎng)的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。
（4）結(jié)果判斷：若哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上有厭氧桿菌生長(zhǎng)（有或無(wú)芽孢），且過氧化氫酶反應(yīng)陰性的，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為梭菌；如果哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有厭氧桿菌生長(zhǎng)，或雖有相符或疑似的菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或過氧化氫酶反應(yīng)陽(yáng)性，判供試品未檢出梭菌。
3.5.11 白色念珠菌
（1）供試液制備和增菌培養(yǎng)：取供試品，照3.3.1的內(nèi)容制成1：10供試液。取相當(dāng)于1g或1ml、1貼或10cm²供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，混勻，30~35℃培養(yǎng)3~5天。
（2）選擇和分離培養(yǎng)：取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)24~48小時(shí)。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有褶皺。挑取疑似菌落接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24~48小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)），或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。
（3）結(jié)果判斷：若沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長(zhǎng)，且疑似菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落呈陽(yáng)性反應(yīng)，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為白色念珠菌；若沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，或疑似菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落呈陰性反應(yīng)，判供試品未檢出白色念珠菌。
4.中美藥典微生物限度檢查法差異
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區(qū)別 |
中國(guó)藥典 |
美國(guó)藥典 |
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菌種來(lái)源不同 |
CMCC |
ATCC/NCIMB/CIP/ NBRC |
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培養(yǎng)基適用性檢查頻率描述不同 |
每批控制菌檢查用的商品化的預(yù)制培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)符合培養(yǎng)基的適用性檢查的要求。 |
Test each batch of ready-prepared medium and each batch of medium prepared either from dehydrated medium or from the ingredients described. |
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測(cè)試每一批現(xiàn)成的培養(yǎng)基和每一批用脫水培養(yǎng)基或所述成分制備的培養(yǎng)基。 |
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對(duì)照培養(yǎng)基不同 |
被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。 |
For solid media, growth obtained must not differ by a factor greater than 2 from the calculated value for a standardized inoculum. For a freshly prepared inoculum, growth of the microorganisms comparable to that previously obtained with a previously tested and approved batch of medium occurs. Liquid media are suitable if clearly visible growth of the microorganisms comparable to that previously obtained with a previously tested and approved batch of medium occurs. |
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對(duì)于固體培養(yǎng)基，獲得的生長(zhǎng)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)接種物的計(jì)算值相差不得超過2倍。對(duì)于新制備的接種物，微生物的生長(zhǎng)情況應(yīng)與之前使用經(jīng)對(duì)于新鮮制備的接種物，微生物的生長(zhǎng)情況應(yīng)與先前使用經(jīng)測(cè)試和批準(zhǔn)的培養(yǎng)基批次所獲得的生長(zhǎng)情況相當(dāng)。液體培養(yǎng)基適用于以下情況液體培養(yǎng)基的適用條件是，微生物的生長(zhǎng)情況與使用先前經(jīng)測(cè)試和批準(zhǔn)的培養(yǎng)基批次所獲結(jié)果相當(dāng)。 |
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膜過濾法的沖洗量 |
若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗量一般不超過500ml，最多不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。 |
Rinse the membrane filter with an appropriate volume of diluent. |
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用適量稀釋液沖洗膜過濾器。 |
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檢驗(yàn)量 |
除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g /10ml;膜劑、貼劑和貼膏劑為100cm2。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑、貼劑和貼膏劑還不得少于4片。 |
Unless otherwise directed, use 10 g or 10 mL of the product to be examined taken with the precautions referred to above. For fluids or solids in aerosol form, sample 10 containers. For transdermal patches, sample 10 patches. |
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除非另有說明，在采取上述預(yù)防措施的情況下，使用10克或10毫升待檢產(chǎn)品。 |
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對(duì)于氣霧劑形式的液體或固體，取樣10個(gè)容器。對(duì)于透皮貼劑，取樣10片。 |
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減少檢驗(yàn)量的情況 |
制劑的檢驗(yàn)量在滿足以下條件可以酌減，若批產(chǎn)量少于200的供試品（如臨床研究樣品)，檢驗(yàn)量可減少至2個(gè)單位；若批產(chǎn)量少于100的供試品，檢驗(yàn)量可減少至1個(gè)單位，貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減，檢驗(yàn)量減少時(shí)需進(jìn)行合理性評(píng)估；氣霧劑的檢驗(yàn)量應(yīng)不少于10個(gè)包裝單位。原料藥的檢驗(yàn)量在滿足以下條件可以酌減:若單劑量(如每片、每膠囊或每支)產(chǎn)品中活性物質(zhì)含量小于或等于1mg，或多劑量產(chǎn)品每1g或每1ml中活性物質(zhì)含量小于1mg時(shí)，原料藥的檢驗(yàn)量應(yīng)不少于10個(gè)劑量單位或10g或10ml產(chǎn)品中所含原料的量。若樣品量有限或批產(chǎn)量極小(如小于1000ml或1000g)的活性物質(zhì)供試品。除另有規(guī)定外，其檢驗(yàn)量最少為批產(chǎn)量的1%。 |
The amount to be tested may be reduced for active substances that will be formulated in the following conditions: the amount per dosage unit (e.g., tablet, capsule, injection) is less than or equal to 1 mg, or the amount per g or mL (for preparations not presented in dose units) is less than 1 mg. In these cases, the amount of sample to be tested is not less than the amount present in 10 dosage units or 10 g or 10 mL of the product. |
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For materials used as active substances where the sample quantity is limited or batch size is extremely small (i.e., less than 1000 mL or 1000 g), the amount tested shall be 1% of the batch unless a lesser amount is prescribed or justified and authorized. For products where the total number of entities in a batch is less than 200(e.g., samples used in clinical trials), the sample size may be reduced to two units, or one unit if the size is less than 100. |
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在下列條件下配制的活性物質(zhì)，其待測(cè)量可以減少：每個(gè)劑量單位（如片劑、膠囊、注射劑）的量少于或等于1毫克，或每克或每毫升（非劑量單位的制劑）的量少于1毫克。在這些情況下，待測(cè)樣品量不少于10個(gè)劑量單位或10克或10毫升產(chǎn)品中的含量。 |
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對(duì)于用作活性物質(zhì)的材料，如果樣品量有限或批量極小（即小于1000 毫升或 1000 克），檢測(cè)量應(yīng)為批量的1%，除非規(guī)定或有正當(dāng)理由并獲得授權(quán)。 |
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對(duì)于批量中實(shí)體總數(shù)少于200個(gè)的產(chǎn)品（如用于臨床試驗(yàn)的樣品），樣品量可減至2個(gè)單位，如果少于100個(gè)，則減至1個(gè)單位。 |
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膜過濾法過濾體積 |
取相當(dāng)于1g、1m l或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過濾。 |
When examining transdermal patches, separately filter 10% of the volume of the preparation described for Preparation of the Sample through each of two sterile filter membranes. Transfer one membrane to Soybean–Casein Digest Agar for TAMC and the other membrane to Sabouraud Dextrose Aga r for TYMC. |
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檢查透皮貼片時(shí)，用兩張無(wú)菌濾膜分別過濾 10%的 "樣品制備 "中所述的制備液。將一個(gè)濾膜轉(zhuǎn)移到大豆-酪蛋白消化瓊脂中以檢測(cè) TAMC，將另一個(gè)濾膜轉(zhuǎn)移到沙氏葡萄糖瓊脂中以檢測(cè) TYMC。 |
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平皿法中對(duì)平行樣差距的要求 |
若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于1 5，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于250cfu的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于50CFU稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù) |
Select the plates corresponding to a given dilution and showing the highest number of colonies less than 250 for |
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TAMC and 50 for TYMC. |
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選擇與給定稀釋度相對(duì)應(yīng)且菌落數(shù)最多的平板，TAMC 平板上的菌落數(shù)少于250 個(gè)，TYMC 平板上的菌落數(shù)少于50個(gè)。 |
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TAMC 為 250 個(gè)，TYMC為50個(gè)。 |
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菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 |
取兩位有效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以< 1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù) |
無(wú)類似要求 |
5.中美藥典微生物限度標(biāo)準(zhǔn)差異
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區(qū)別
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中國(guó)藥典
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美國(guó)藥典
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直腸給藥制劑控制菌
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不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（lg或1 ml)
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無(wú)要求
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口腔黏膜給藥制劑、齒齦用藥、鼻用制劑
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不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（1g、1ml或10cm²)
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Absence of Staphylococcus aureus (1g or 1mL)
Absence of Pseudomonas aeruginosa (1g or1mL)
不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（lg或1 ml)
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關(guān)于中藥的要求
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有單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)
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無(wú)
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對(duì)沙門氏菌的要求
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口服給藥含臟器提取物的制劑還不得檢出沙門菌（10 g 或10ml)
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無(wú)
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京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
