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摘 要： 利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定蜂蜜中7種硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)80%（體積分?jǐn)?shù)）的乙腈溶液超聲提取，提取液經(jīng)稀釋后，用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離，在電噴霧正離子模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用內(nèi)標(biāo)法定量。9種硝基咪唑類化合物的質(zhì)量濃度在0.05～10.0 µg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法檢出限為0.2 µg/kg，定量限為0.5 µg/kg?？瞻讟悠返募訕?biāo)平均回收率為60.8%～117%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%（n=6）。該方法簡(jiǎn)便、快捷，可用于蜂蜜中硝基咪唑類藥物及其代謝物的定性定量分析。

 

關(guān)鍵詞： 硝基咪唑類藥物； 代謝物； 蜂蜜； 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

 

硝基咪唑類藥物是分子結(jié)構(gòu)中含有5-硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物[1]，具有殺菌能力強(qiáng)、抗厭氧菌譜廣、見效快、成本低等特點(diǎn)[2?4]，廣泛應(yīng)用于畜禽等動(dòng)物養(yǎng)殖領(lǐng)域，可用于促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)以及治療畜禽滴蟲病、厭氧菌感染等疾病[5]。甲硝唑(MNZ)、二甲硝唑(DMZ)、洛硝噠唑(RNZ)、奧硝唑(ONZ)、替硝唑(TNZ)、異丙硝唑(IPZ)、苯硝咪唑(5-BNZ)等人工合成型硝基咪唑類化合物是硝基咪唑類藥物的代表，羥基甲硝唑(MNZOH)和羥甲基甲硝咪唑(HMMNI)分別為甲硝唑和二甲硝唑的代謝物。該類藥物具有遺傳毒性，能夠致癌、致畸、致突變[5?8]，對(duì)動(dòng)物源性食品安全和人體健康造成極大威脅。美國(guó)已禁止將硝基咪唑類藥物用于食用動(dòng)物的疾病治療[5]，歐盟理事會(huì)將MNZ、DMZ和RNZ列入A類禁用藥物，不得在任何食品中檢出[1,9-10]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)[11]及GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)　食品中獸藥最大殘留限量》均明確規(guī)定：甲硝唑和地美硝唑作為獸藥允許用于治療，但應(yīng)嚴(yán)格遵守休藥期管理要求。同時(shí)還規(guī)定：甲硝唑、二甲硝唑及其鹽、酯和制劑，禁止以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為目的在所有食品動(dòng)物飼養(yǎng)過程中使用[11?14]。NY/T 752—2020《綠色食品　蜂產(chǎn)品》規(guī)定：不得檢出硝基咪唑類藥物。

 

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，其營(yíng)養(yǎng)豐富，是常用滋補(bǔ)品。我國(guó)蜂蜜產(chǎn)業(yè)歷史悠久，生產(chǎn)和出口量均居世界首位[15]。在2020年以前，硝基咪唑類抗生素常被用于預(yù)防蜜蜂病害，而未代謝的抗生素會(huì)殘留至蜂蜜中，從而影響其食用安全[16]。近年來(lái)，在蜂蜜中檢出硝基咪唑類藥物殘留的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[17?18]，因此，建立硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的檢測(cè)方法，對(duì)食品安全監(jiān)管具有重要意義。目前硝基咪唑類藥物殘留量的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19?20]、液相色譜法[21?23]、液相色譜-質(zhì)譜法[24?26]等。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需衍生化，操作繁瑣；高效液相色譜法靈敏度較低、無(wú)法準(zhǔn)確定性；液相色譜-質(zhì)譜法具有選擇性好、靈敏度高、無(wú)需衍生化等優(yōu)點(diǎn)。GB/T 23410—2009《蜂蜜中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量的測(cè)定　液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中，用乙酸乙酯提取蜂蜜中7種硝基咪唑類藥物及其代謝物，蒸干提取溶液后利用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定，用內(nèi)標(biāo)法定量，定量限為1.0～2.0 μg/kg。

 

目前研究硝基咪唑類藥物的文獻(xiàn)較多，而測(cè)定蜂蜜中甲硝唑、二甲硝唑、洛硝噠唑、奧硝唑、替硝唑、異丙硝唑、苯硝咪唑及其代謝物羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的文獻(xiàn)極少。凌莉等[16]建立了同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中氯霉素和5種硝基咪唑的方法，用乙酸乙酯提取樣品，提取液經(jīng)氮吹濃縮后進(jìn)行檢測(cè)；吳明等[8]采用多次推送過濾凈化法-液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中16種硝基咪唑類和苯并咪唑類抗生素，樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后，利用多層修飾復(fù)合納米材料凈化后進(jìn)行檢測(cè)。筆者采用80%(體積分?jǐn)?shù))乙腈溶液超聲提取蜂蜜樣品，提取液經(jīng)稀釋后，用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離，在電噴霧正離子模式下，利用自動(dòng)分段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集數(shù)據(jù)，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中甲硝唑、二甲硝唑、洛硝噠唑、奧硝唑、替硝唑、異丙硝唑、苯硝咪唑7種硝基咪唑類藥物及其代謝物羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑。該方法樣品處理簡(jiǎn)單，適用于蜂蜜中7種硝基咪唑類藥物及其代謝物的同時(shí)檢測(cè)，可為監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：SCL-40型，日本島津公司。三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：AB SCIEX QTRAP 6500+型，美國(guó)愛博才思公司。超聲波清洗器：SB-4200DT型，寧波新芝生物科技股份有限公司。旋渦混合器：UMV-2型，北京普立泰科儀器有限公司。臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：ALLEGRA X-12R型，美國(guó)貝克曼公司。超純水系統(tǒng)：IQ7000型，美國(guó)密理博公司。甲醇、乙腈：均為色譜純，德國(guó)默克公司。氮?dú)獍l(fā)生器：Genius3040型，上海畢克氣體儀器貿(mào)易公司。9種硝基咪唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：甲硝唑、二甲硝唑、洛硝噠唑、奧硝唑、替硝唑、異丙硝唑、苯硝咪唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的質(zhì)量濃度均為10.0 μg/mL，介質(zhì)為甲醇，貨號(hào)為1ST48225-10M，天津阿爾塔科技有限公司。4種同位素標(biāo)記物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：甲硝唑-d4、羥基甲硝唑-d2、二甲硝唑-d3和洛硝噠唑-d3的質(zhì)量濃度均為10.0 μg/mL，介質(zhì)為甲醇，貨號(hào)為1ST48226-10M，天津阿爾塔科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由IQ7000型超純水儀制備。

1.2 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確吸取9種硝基咪唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，配制成9種化合物質(zhì)量濃度均為1.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃下避光貯存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確量取1.00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液(體積比為1∶9，下同)定容至標(biāo)線，配制成9種化合物質(zhì)量濃度均為100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，現(xiàn)用現(xiàn)配?；旌蟽?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確吸取1.00 mL 4種同位素標(biāo)記物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，配制成4種化合物質(zhì)量濃度均為1.00 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20 ℃下避光貯存。混合內(nèi)標(biāo)中間液：準(zhǔn)確量取1.00 mL混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至標(biāo)線，配制成4種化合物質(zhì)量濃度均為100 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)中間液，現(xiàn)用現(xiàn)配。系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，置于9只10 mL容量瓶中，各加入100 µL混合內(nèi)標(biāo)中間液，用甲醇溶液定容至標(biāo)線，配制成9種化合物質(zhì)量濃度均分別為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 µg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。其中，內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為1.0 μg/L。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜儀

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)沃特世公司)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2.0 µL；運(yùn)行時(shí)間：9 min；流動(dòng)相：A相為水，B相為乙腈，流量為0.35 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序見表1。

表1   梯度洗脫程序

Tab. 1   Gradient elution program

 

1.3.2 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子模式；離子化電壓：5 500 V；霧化氣：氮?dú)猓瑝毫?45 kPa；氣簾氣：氮?dú)?，壓力?07 kPa；輔助氣：氮?dú)?，壓力?79 kPa；離子源溫度：450 ℃；碰撞池出口電壓：10 V；監(jiān)測(cè)方式：自動(dòng)分段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM模式。9種硝基咪唑類化合物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2   9種硝基咪唑類化合物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

Tab. 2   Mass spectrometry parameters of 9 nitroimidazole compounds and internal standards

注：帶*號(hào)的為定量離子。

 

1.4 樣品處理

將采集的蜂蜜樣品混合均勻，稱取2.0 g混合后的樣品(精確至0.01 g)，加入100 µL混合內(nèi)標(biāo)中間液，渦旋振蕩1 min，再加入10 mL 80% (體積分?jǐn)?shù))乙腈溶液，混勻后超聲提取30 min，在4 ℃下，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。準(zhǔn)確吸取0.5 mL上清液，加入0.5 mL水，混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，濾液即為樣品溶液。以水代替蜂蜜樣品，同法制備空白樣品溶液。

1.5 定量方法

在1.3儀器工作條件下，由低濃度到高濃度依次對(duì)9種硝基咪唑類系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中9種硝基咪唑類藥物及其代謝物的含量。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

硝基咪唑類化合物中羥基和硝基易形成[M+H]+正離子，在正離子模式下具有較好的響應(yīng)，故選擇正離子掃描模式。在ESI+模式下，通過Q1MS掃描和子離子掃描，尋找合適的母離子和子離子，選擇不易被干擾的離子作為定量離子，選擇比定量離子響應(yīng)稍低的離子作為定性離子，組建MRM離子對(duì)，同時(shí)優(yōu)化碰撞能量、去簇電壓等參數(shù)。運(yùn)用自動(dòng)分段監(jiān)測(cè)方式，在MRM列表中輸入各對(duì)應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間，以便更好地識(shí)別目標(biāo)化合物，提高分析效率和定量準(zhǔn)確性。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 流動(dòng)相選擇

硝基咪唑類化合物易溶于乙腈、甲醇。分別考察0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈(含0.1%甲酸)和水-乙腈3種流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以水-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，目標(biāo)物的色譜峰形最好，檢測(cè)靈敏度較高，故選擇水-乙腈作為流動(dòng)相。9種硝基咪唑類化合物的總離子流色譜圖如圖1所示。

 1—羥基甲硝唑； 2—羥甲基甲硝咪唑； 3—甲硝唑； 4—洛硝噠唑；5—二甲硝唑； 6—替硝唑； 7—苯硝咪唑；8—奧硝唑； 9—異丙硝唑

圖1　9種硝基咪唑類化合物的總離子流色譜圖

Fig.1   Total ion chromatogram of 9 nitroimidazole compounds

2.3 提取溶劑選擇

目前硝基咪唑類化合物的提取溶劑多為乙腈，乙腈是一種極性溶劑，分子小，組織穿透能力強(qiáng)，同時(shí)對(duì)蛋白的沉淀效果較好，對(duì)目標(biāo)化合物均有較好的提取效果。汪瓊等[27]選擇2%三氯乙酸作為提取溶劑提取禽肉及禽蛋中硝基咪唑類藥物，獲得了良好的回收率。由于硝基咪唑類藥物為堿性化合物，在弱酸性條件下有助于提高提取效率，筆者分別用體積分?jǐn)?shù)為2%的三氯乙酸溶液、75%的乙腈溶液(含0.1%甲酸)和80%的乙腈溶液對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行提取，考察不同提取溶劑對(duì)目標(biāo)物的提取效果。其中用2%三氯乙酸溶液提取時(shí)，提取液需要過MCX固相萃取柱凈化后氮吹濃縮，然后用10%甲醇溶液復(fù)溶后進(jìn)行檢測(cè)；用75%乙腈溶液(含0.1%甲酸)提取時(shí)，提取液需氮吹濃縮，然后用5%乙腈溶液復(fù)溶后進(jìn)行檢測(cè)；用80%乙腈溶液提取時(shí)，提取液經(jīng)稀釋后直接進(jìn)行檢測(cè)。不同提取溶劑時(shí)9種硝基咪唑類化合物的回收率如圖2所示。由圖2可以看出，分別選擇3種提取溶劑提取時(shí)，9種目標(biāo)物的回收率沒有明顯變化，但用2%三氯乙酸溶液和75%乙腈溶液(含0.1%甲酸)提取時(shí)，操作繁瑣，因此選擇80%乙腈溶液作為提取溶劑。

圖2   不同提取溶劑時(shí)9種硝基咪唑類化合物回收率

Fig.2   Recoveres of 9 nitroimidazole compounds at different extraction solvents

2.4 凈化方法選擇

以80%乙腈溶液為提取溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取，考察不同凈化方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。具體方法：(1)提取液不凈化，用等體積的水稀釋后直接測(cè)定；(2)提取液用PSA (乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠)凈化后測(cè)定；(3)提取液用PSA和C18 (十八烷基硅烷鍵合硅膠)凈化后測(cè)定。提取液不同凈化方法時(shí)9種硝基咪唑類化合物的回收率見表3。由表3可知，提取液不經(jīng)過凈化，用等體積的水稀釋后直接測(cè)定時(shí)，9種硝基咪唑類化合物的回收率最高，因此選擇提取液用等體積的水稀釋后直接測(cè)定。

表3   不同凈化方法時(shí)9種硝基咪唑類化合物的回收率

Tab. 3   Recoveries of 9 nitroimidazole compounds under different purification methods %

 

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(EM)在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中為常見現(xiàn)象，是由樣品中的基質(zhì)與目標(biāo)物在離子源端競(jìng)爭(zhēng)電離所致，分為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和抑制效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)會(huì)影響目標(biāo)物的靈敏度和準(zhǔn)確度[28]。EM的計(jì)算公式如下：EM=（）×100%式中：k1——基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率；k2——溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)|EM|值為0%～20%時(shí)，存在弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)|EM|值為20%～50%時(shí)，存在中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)|EM|＞50%時(shí)，存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[28]。9種硝基咪唑類化合物的基質(zhì)效應(yīng)見表4。由表4可知，羥基甲硝唑、苯硝咪唑和奧硝唑的|EM|＞50%，存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，其中羥基甲硝唑和奧硝唑存在基質(zhì)增強(qiáng)作用，而苯硝咪唑存在基質(zhì)抑制作用；羥甲基甲硝咪唑的EM值為39.3%，存在中等基質(zhì)增強(qiáng)作用；甲硝唑、二甲硝唑和異丙硝唑存在弱基質(zhì)抑制作用，洛硝噠唑和替硝唑存在弱基質(zhì)增強(qiáng)作用。

表4   9種硝基咪唑類化合物的內(nèi)標(biāo)物及基質(zhì)效應(yīng)

Tab. 4   Internal standards and matrix effects of 9 nitroimidazole compounds

 

消除基質(zhì)效應(yīng)的常見方法通常有使用內(nèi)標(biāo)法定量、采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線法定量、優(yōu)化樣品凈化方法等[29]。筆者采用內(nèi)標(biāo)法定量來(lái)降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.6 線性方程與檢出限

在1.3儀器工作條件下，測(cè)定系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。在空白蜂蜜樣品中加入較低濃度的9種硝基咪唑類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4方法進(jìn)行處理，在1.3儀器工作條件下測(cè)定，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限和定量限，根據(jù)取樣質(zhì)量為2.0 g，定容體積為10 mL，換算成樣品中的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(µg/kg)表示。9種硝基咪唑類化合物的線性范圍(質(zhì)量濃度)、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表5。

表5   9種硝基咪唑類化合物線性范圍(質(zhì)量濃度)、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

Tab. 5   Linear ranges (mass concentration)，linear equations，correlation coefficients，detection limits，and quantification limitsof 9 nitroimidazole compounds

 

2.7 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

在空白蜂蜜樣品中加入9種硝基咪唑類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行低(0.5 µg/kg)、中(2.0 µg/kg)、高(25 µg/kg) 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次，結(jié)果見表6。由表6可知，9種硝基咪唑類化合物加標(biāo)平均回收率為60.8%～117%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)相差2.4%～19%，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范　食品理化檢測(cè)》中回收率為60%～120%、測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)相差小于21%的技術(shù)要求。

表6   樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 6   Results of samples spiked recovery and precision test

 

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中甲硝唑、洛硝噠唑、異丙硝唑、二甲硝唑、替硝唑、苯硝咪唑、奧硝唑及其代謝物羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑等藥物殘留。樣品經(jīng)80%(體積分?jǐn)?shù))的乙腈溶液超聲提取，提取液用等體積的水稀釋直接進(jìn)樣測(cè)定。選擇同位素內(nèi)標(biāo)消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾。該方法簡(jiǎn)便、快捷，能夠滿足大批量蜂蜜樣品的檢測(cè)要求。由于替硝唑、苯硝咪唑、奧硝唑、異丙硝唑和羥甲基甲硝咪唑目前沒有對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)，選擇二甲硝唑-d3作為奧硝唑的內(nèi)標(biāo)，選擇洛硝噠唑-d3作為替硝唑、苯硝咪唑、異丙硝唑和羥甲基甲硝咪唑的內(nèi)標(biāo)。考慮其他使用同位素內(nèi)標(biāo)定量的化合物回收率較好，如能用相匹配的同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，該方法將會(huì)達(dá)到更理想的回收率，有待進(jìn)一步研究。

 

參考文獻(xiàn)

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