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摘要

目的：優(yōu)化高效液相色譜測(cè)定右佐匹克隆片中吡嗪-2，3羧酸的方法，解決同一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同廠家右佐匹克隆片中吡嗪-2，3羧酸峰判斷和扣除的問(wèn)題。

方法：采用高效液相色譜法對(duì)多個(gè)輔料進(jìn)行初篩，確定雜質(zhì)來(lái)源后，優(yōu)化色譜條件，最終采用Venusil MP C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；以水[用磷酸調(diào)節(jié)pH值至（1.5±0.02）]為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0~10min，3%B；10~16min，3%~80%B；16~25min，80%B；25.1~35min，3%B）；流速為1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為5μL。

結(jié)果：通過(guò)方法學(xué)考察，吡嗪-2，3羧酸在0.07975~15.95μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，專屬性、重復(fù)性、穩(wěn)定性及準(zhǔn)確度良好。

結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于右佐匹克隆片中吡嗪-2，3羧酸的測(cè)定。

關(guān)鍵詞

右佐匹克隆片；吡嗪-2，3羧酸；高效液相色譜法

右佐匹克隆片為外消旋體佐匹克隆的S異構(gòu)體，為第3代非苯二氮?類(lèi)鎮(zhèn)靜催眠藥，具有口服吸收快、生物利用度高和半衰期適中等藥動(dòng)學(xué)特征。該藥品為2019年和2023年的國(guó)家藥品抽檢品種，根據(jù)收集到的調(diào)研資料，分析各廠家的合成路線，吡嗪-2，3羧酸為水解產(chǎn)物又是降解雜質(zhì)，是佐匹克隆和右佐匹克隆的重要起始物料，我們采用美國(guó)Simulations Plus公司的ADMET性質(zhì)預(yù)測(cè)軟件ADMET Predictor，對(duì)吡嗪-2，3羧酸的毒理性質(zhì)參數(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其會(huì)被人肝微粒體少量代謝，清除率較低，會(huì)導(dǎo)致一些肝藥酶的水平升高，提示可能具有肝毒性。目前關(guān)于右佐匹克隆片中吡嗪-2，3羧酸檢測(cè)方法的研究較少，2020年版《中國(guó)藥典》也未將該項(xiàng)目納入標(biāo)準(zhǔn)，僅有兩個(gè)局頒標(biāo)準(zhǔn)中收載了右佐匹克隆片中吡嗪-2，3羧酸的檢測(cè)方法，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中收載兩個(gè)廠家的色譜條件不同，無(wú)統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，且有一個(gè)廠家的4批樣品采用兩種方法檢驗(yàn)結(jié)果相差較大，檢出范圍分別為0.006%~0.015%和0.03%~0.06%。因此，本研究通過(guò)考察現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中存在的問(wèn)題，優(yōu)化檢測(cè)方法，為生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供參考。

1儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Mettler XSE205DU電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300DB型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

磷酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，Honeywell），水為二級(jí)實(shí)驗(yàn)用水；吡嗪-2，3羧酸對(duì)照品（CATO，批號(hào)：0215-RE-0017，含量：100%）；右佐匹克隆片分別來(lái)自A公司（批號(hào)：C0512022001、C0532022041、C0532022040）、B公司（批號(hào)：2M0531D67、2M0541D67、2K0391D67）、C公司（批號(hào)：202208162、20221110、202209012、202211032）、D公司（批號(hào)：221101、221102）、E公司（批號(hào)：3B012、3B011、3B022）。

2方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱采用Venusil MP C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為水[用磷酸調(diào)節(jié)pH值至（1.5±0.02）]（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0~10min，3%B；10~16min，3%~80%B；16~25min，80%B；25.1~35min，3%B）；流速為1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為5μL。

2.2 溶劑的配制

溶劑為流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（97∶3）。

2.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取吡嗪-2，3羧酸對(duì)照品適量，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1mL中約含8μg的溶液。

2.4 供試品溶液的配制

取本品20片，精密稱定，研細(xì)，取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于右佐匹克隆8mg），精密稱定，置10mL量瓶中，加溶劑約7mL，冷水超聲15min并振搖，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.5 加乳糖對(duì)照品溶液

精密稱取吡嗪-2，3羧酸對(duì)照品適量，精密稱定，加入處方量的乳糖細(xì)粉，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1mL中約含8μg吡嗪-2，3羧酸的溶液。

2.6 陰性樣品溶液的配制

依據(jù)各廠家處方比例配制不含右佐匹克隆的粉末作為混合陰性樣品。精密稱定該粉末適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，即得陰性樣品溶液。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性試驗(yàn)

精密吸取溶劑、陰性樣品溶液、吡嗪-2，3羧酸對(duì)照品溶液、加乳糖對(duì)照品溶液以及供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品中的輔料不干擾吡嗪-2，3羧酸的檢測(cè)，乳糖峰與吡嗪-2，3羧酸峰分離度大于1.5，如圖1所示。

2.7.2 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，結(jié)果吡嗪-2，3羧酸峰峰面積的RSD值為0.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為202211032的右佐匹克隆片樣品6份，加入吡嗪-2，3羧酸對(duì)照品溶液適量，按照“2.4”項(xiàng)下方法配制，制得加標(biāo)供試品溶液，進(jìn)樣分析，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為0.007%，最大值為0.0074%，最小值為0.0057%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液及批號(hào)為202211032的供試品溶液，置于室溫條件下，分別在配制后的0、4、8、12、24h進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算吡嗪-2，3羧酸峰峰面積的RSD值分別為1.6%和4.3%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫條件下24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.5 檢測(cè)限與定量限

精密稱取吡嗪-2，3羧酸對(duì)照品，用溶劑逐級(jí)稀釋，按信噪比（S/N）≈3和S/N≈10測(cè)定檢測(cè)限和定量限，結(jié)果檢測(cè)限和定量限分別為相當(dāng)于供試品溶液的0.004%和0.01%。

2.7.6 線性關(guān)系考察

精密稱取吡嗪-2，3羧酸對(duì)照品15.95mg，置20mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，作為線性儲(chǔ)備液。分別精密量取上述溶液適量，加溶劑逐級(jí)稀釋制成線性梯度溶液，以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：Y=11.1239X-0.2193，r=0.9998，結(jié)果吡嗪-2，3羧酸在0.07975~15.95μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.7.7 回收試驗(yàn)

取批號(hào)為202211032的供試品，研細(xì)，精密稱取粉末9份（約相當(dāng)于右佐匹克隆8mg），分別精密加入低、中、高3個(gè)濃度對(duì)照品儲(chǔ)備液，按照“2.4”項(xiàng)下方法制備，每個(gè)濃度平行制備3份，對(duì)9份樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果如表1所示。

2.8 樣品測(cè)定

對(duì)5個(gè)廠家的原料及樣品中吡嗪-2，3羧酸的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果5批右佐匹克隆原料均未檢出，1批樣品檢出量為0.002%（小于檢測(cè)限：0.004%），1批樣品檢出量為0.008%；其余3批為未檢出。

3討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用DAD檢測(cè)器在190~400nm波長(zhǎng)對(duì)吡嗪-2，3羧酸對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在200nm和274nm波長(zhǎng)處均有最大吸收峰，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中其測(cè)定波長(zhǎng)為209nm或270nm，但由于在低波長(zhǎng)下易受溶劑影響，且基線波動(dòng)較大，因此考慮雜質(zhì)的檢出靈敏度，選擇270nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜柱的選擇

采用C18色譜柱，但不同品牌和填料修飾其分離效果有差異，對(duì)比了3個(gè)品牌的色譜柱，分別是Venusil MP C18（4.6mm×250mm，5μm）、YMC-tirart C18（4.6mm×250mm，5μm）、CAPCELL PAK C18（4.6mm×250mm，5μm），結(jié)果發(fā)現(xiàn)Venusil MP C18柱（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱分離效果最好，因此最終選擇該色譜柱進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 流動(dòng)相pH的選擇

由于該雜質(zhì)為酸性物質(zhì)，pKa為（1.66±0.10），酸性物質(zhì)需在酸性體系下才不容易被解離，從而增加在反相柱上的保留時(shí)間。因此建議將流動(dòng)相A用磷酸調(diào)節(jié)pH值至（1.5±0.02），而未選擇現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中在流動(dòng)相中加入固定量的磷酸，這是由于不同品牌磷酸含量不同，最終可能導(dǎo)致流動(dòng)相pH值產(chǎn)生誤差影響出峰時(shí)間。

3.4 提取溶劑的選擇

本研究考察了現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的溶劑[磷酸鹽緩沖液-乙腈（70∶30），用磷酸調(diào)節(jié)pH值至（2.5±0.05）]，由于流動(dòng)相初始比例水相比例較大，在部分儀器上會(huì)產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，造成色譜峰變形，對(duì)儀器的選擇性較高，而吡嗪-2，3羧酸易溶于水，因此按照流動(dòng)相初始比例調(diào)整為水[用磷酸調(diào)節(jié)pH值至（1.5±0.02）]-甲醇（97∶3）作為提取溶劑。

3.5 不同來(lái)源輔料的影響

針對(duì)輔料干擾吡嗪-2，3羧酸檢測(cè)的問(wèn)題，采用高效液相色譜法對(duì)多個(gè)輔料進(jìn)行初篩，確定干擾峰來(lái)源于乳糖，對(duì)不同廠家的乳糖進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)來(lái)源分別為進(jìn)口的Molkerei MEGGLE Wasserburg GmbH&Co. KG和國(guó)產(chǎn)的上海華茂藥業(yè)有限公司。不同廠家乳糖的干擾峰大小有較大差別，因此對(duì)于不同廠家來(lái)源的輔料應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況具體分析，且應(yīng)對(duì)輔料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升來(lái)加強(qiáng)產(chǎn)品質(zhì)量的整體把控。

本文通過(guò)探索性研究，發(fā)現(xiàn)局頒標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法對(duì)于處方中添加乳糖的樣品存在影響雜質(zhì)峰判斷和扣除的問(wèn)題，輔料干擾質(zhì)控，這不僅會(huì)影響分析者的判斷，更會(huì)給產(chǎn)品的質(zhì)控帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，而乳糖作為一種常用的輔料，廣泛用作片劑和膠囊的填充劑或稀釋劑，且用量較大，如果輔料中有使用到乳糖，就有可能干擾吡嗪-2，3羧酸的檢測(cè)，影響峰的判斷，因此本研究通過(guò)高效液相色譜法對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了優(yōu)化，排除了吡嗪-2，3羧酸峰誤判的可能，可為右佐匹克隆片質(zhì)量控制提供參考。