1 背景介紹
根據(jù)不同的抗體-抗原結(jié)合策略和信號(hào)放大方式，ELISA衍生出多種方法，包括：直接法、間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，它們適用于不同的檢測(cè)需求。
下面我們將系統(tǒng)闡述這4類常見ELISA的技術(shù)原理，幫助你快速區(qū)分這幾種方法之間的不同。
圖：hardydiagnostics
2 實(shí)驗(yàn)原理
ELISA實(shí)驗(yàn)的核心在于酶催化底物顯色的反應(yīng)。
當(dāng)目標(biāo)分子被捕獲并與酶（如辣根過(guò)氧化物酶HRP）標(biāo)記的抗體結(jié)合后，加入無(wú)色底物（如TMB），HRP催化TMB與H?O?發(fā)生氧化反應(yīng)，生成藍(lán)色的可溶性產(chǎn)物（TMB二聚體），此時(shí)溶液呈現(xiàn)明顯藍(lán)色。
隨后加入酸性終止液，酸性條件下氧化態(tài)TMB結(jié)構(gòu)改變，藍(lán)色迅速轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，最終通過(guò)測(cè)量吸光度值實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子定量——顏色越深表明初始目標(biāo)濃度越高。
圖:revvity
3 ELISA的四種主要類型
a 直接法ELISA（Direct ELISA）
直接法ELISA的核心理念在于“簡(jiǎn)單粗暴，一步到位”。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將目標(biāo)抗原固定于固相載體，直接加入酶標(biāo)記的一抗，一抗特異性結(jié)合抗原后，催化底物顯色，顯色強(qiáng)度與抗原濃度成正比。
直接法ELISA的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單、步驟少、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短；僅需一級(jí)抗體，不需要二抗，避免了交叉反應(yīng)的可能性。
它的缺點(diǎn)是：一抗需要酶標(biāo)記，成本較高；同時(shí)，因?yàn)闊o(wú)需二抗，所以信號(hào)放大有限，靈敏度不高，特異性有限。
圖：aatbio
b 間接法ELISA（Indirect ELISA）
間接法ELISA是在直接法的基礎(chǔ)上，通過(guò)引入二抗實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，其核心步驟為：抗原包被 → 一抗結(jié)合 → 酶標(biāo)二抗結(jié)合 → 顯色檢測(cè)。
間接法ELISA的優(yōu)點(diǎn)是：一抗無(wú)需標(biāo)記，且一種二抗可適用于多種不同的一抗，降低了成本。同時(shí)，二抗可以放大信號(hào)，提高靈敏度，適用于檢測(cè)血清中的抗體。
它的缺點(diǎn)是：交互反應(yīng)發(fā)生的幾率較高，特異性一般。
c 夾心法ELISA （Sandwich ELISA）
夾心法ELISA是一種非常有效且常用的免疫測(cè)定技術(shù)，以其高特異性和靈敏度著稱，適用于復(fù)雜樣品中目標(biāo)分子的定量分析。
雙抗夾心法就是我們所說(shuō)的夾心法ELISA。“雙抗”指的是在這個(gè)過(guò)程中使用了兩種抗體：一種是捕獲抗體，另一種是檢測(cè)抗體。
圖：leinco
這兩種抗體分別結(jié)合目標(biāo)抗原的不同表位，從而形成“抗體-抗原-抗體”的三明治結(jié)構(gòu)。
捕獲抗體預(yù)先固定于固相載體，捕獲溶液中的目標(biāo)抗原后，檢測(cè)抗體結(jié)合抗原的另一表位，最終信號(hào)強(qiáng)度與抗原濃度正相關(guān)。
夾心法ELISA有兩種主要形式：直接法和間接法。
在直接夾心法ELISA中，檢測(cè)抗體直接用酶標(biāo)記.
間接夾心法ELISA中，則使用未標(biāo)記的檢測(cè)抗體，然后利用酶標(biāo)記的二抗來(lái)放大信號(hào)。
夾心法ELISA的優(yōu)點(diǎn)是：特異性高、靈敏度高，適合復(fù)雜樣品中抗原的檢測(cè)。
但它同時(shí)也有缺點(diǎn)，那就是：無(wú)論采用哪種形式，夾心法都要求目標(biāo)抗原至少有兩個(gè)可被抗體識(shí)別的不同表位，以保證捕獲抗體和檢測(cè)抗體都能與之結(jié)合。
因此這種方法不適用于小分子抗原，因?yàn)樗鼈兛赡軟](méi)有足夠的表位供兩個(gè)抗體同時(shí)結(jié)合。
d 競(jìng)爭(zhēng)法ELISA（Competition ELISA）
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA是專門針對(duì)在樣本中濃度非常低的抗原或小分子抗原檢測(cè)的一種方法。
圖：biorender
其核心步驟為：
1.首先將抗體固定在微孔板表面
2.封閉后加入待測(cè)抗原和已知量的酶標(biāo)記抗原，兩種抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體
3.然后洗去未結(jié)合的抗原，加入底物顯色。
4.而在對(duì)照組中僅加入酶標(biāo)抗原（不加入待測(cè)抗原），此時(shí)酶標(biāo)抗原充分結(jié)合抗體，顯色最深。
因此，競(jìng)爭(zhēng)法的檢測(cè)邏輯與其他方法相反：當(dāng)樣本中目標(biāo)抗原濃度越高，游離抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗體的能力越強(qiáng)，導(dǎo)致固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原減少，最終顯色信號(hào)減弱。
依據(jù)這個(gè)原理，我們就可以通過(guò)顯色梯度建立“濃度-吸光度”負(fù)相關(guān)曲線，從而量化待測(cè)樣本中抗原濃度。
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的優(yōu)點(diǎn)是：適用于小分子或強(qiáng)缺乏多個(gè)表位的半抗原，抗干擾能力。
它的缺點(diǎn)是：信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)物濃度成反比（濃度越高，顯色越弱），因此需精確控制酶標(biāo)抗原量。
3 總結(jié)
講了這么多，下面我們做了一個(gè)表格，將這幾種方法的特點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)比總結(jié)：
希望這篇文章能夠幫助你理解清楚這些方法之間的差異，選擇合適的ELISA方法。
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