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摘 要： 建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定雞內(nèi)金中9種成分的含量，包括腺嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、肌苷、胸苷。選擇GL Sciences Inertsil ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分離柱，以甲醇-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。9種成分的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 8。樣品加標(biāo)平均回收率為95.8%～103%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～0.85%（n=6）。以尿苷為內(nèi)參照物，計(jì)算腺嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、鳥苷、肌苷、胸苷的平均相對(duì)校正因子分別為0.393、0.447、0.390、0.525、0.780、0.824、0.881、1.326。分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定10批樣品，9種成分的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異（相對(duì)偏差均小于3%）。該方法可用于雞內(nèi)金中9種成分的同時(shí)測(cè)定，可為雞內(nèi)金質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考。

 

關(guān)鍵詞： 雞內(nèi)金； 一測(cè)多評(píng)法； 相對(duì)校正因子； 高效液相色譜法

 

雞內(nèi)金為雉科動(dòng)物家雞Gallus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊內(nèi)壁，具有健胃消食，澀精止遺，通淋化石的功效[1]?！侗静輳男隆分姓f(shuō)“雞肫皮一名雞內(nèi)金，一名舭脛。甘平性澀，雞之脾也。能消水谷”[2]。其化學(xué)成分主要包括蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖以及微量的金屬元素等[3]。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部，標(biāo)準(zhǔn)正文無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)目。家雞品種、飼養(yǎng)環(huán)境及飼料不同等都會(huì)導(dǎo)致雞內(nèi)金飲片質(zhì)量產(chǎn)生差異[4]。核苷類成分在植物藥、動(dòng)物藥、菌類及藻類藥材中多有分布，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫功能調(diào)節(jié)、減輕炎性損傷等生物活性[5?6]，是人類維持生命正常活動(dòng)所必需的部分。核苷類成分作為質(zhì)量控制參照物，可用于太白貝母、龍眼肉、大黃等飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)[7?9]。雞內(nèi)金富含核苷類成分，樊佳等[10]以40批雞內(nèi)金樣品為研究對(duì)象，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法確定了雞內(nèi)金中含有10種水溶性核苷類成分，測(cè)定其中7種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為182.5～416.8 μg/g，通過(guò)液相色譜法建立的雞內(nèi)金指紋圖譜共識(shí)別出14個(gè)共有峰，相似度均在0.914以上；劉天祎等[11]通過(guò)液相色譜法確定了醋雞內(nèi)金配方顆粒中4種水溶性核苷類成分，測(cè)定尿苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35～0.91 mg/g、鳥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.36～0.85 mg/g，建立的醋雞內(nèi)金配方顆粒特征圖譜共識(shí)別出9個(gè)特征峰，相似度均在0.990以上。雞內(nèi)金的傳統(tǒng)功效呈現(xiàn)多靶點(diǎn)(消化、泌尿、生殖系統(tǒng))[12]特性，這與其所含多種核苷類成分的藥理作用密切相關(guān)。研究表明，腺苷可通過(guò)激活A(yù)2 A受體調(diào)節(jié)胃腸平滑肌收縮，緩解食積引起的脘腹脹滿，同時(shí)抑制腎小管炎癥反應(yīng)，改善腎虛不固導(dǎo)致的遺精、尿頻[13?14]；尿苷通過(guò)其代謝產(chǎn)物支持細(xì)胞的能量代謝，維持腎臟的正常功能，從而間接減少結(jié)石的形成風(fēng)險(xiǎn)[15]；肌苷作為能量代謝的關(guān)鍵媒介，可增強(qiáng)胃腸黏膜和腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)能力，協(xié)同實(shí)現(xiàn)“消食”“止遺”的雙重功效[16]。上述研究結(jié)果說(shuō)明，核苷類成分在雞內(nèi)金中普遍存在，且相互協(xié)同發(fā)揮功效，各成分具有內(nèi)在聯(lián)系。在多成分測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)[10?11]基礎(chǔ)上，結(jié)合核苷類成分具有相似結(jié)構(gòu)(堿基+戊糖)，可采用一測(cè)多評(píng)(QAMS)法測(cè)定雞內(nèi)金中多種成分含量。QAMS法的原理是通過(guò)選擇一種代表性成分作為內(nèi)參物，建立該成分與其他目標(biāo)成分之間的相對(duì)校正因子(RCF)，從而僅需測(cè)定一種內(nèi)參物即可推算出多種成分的含量。與外標(biāo)法(ESM)、標(biāo)準(zhǔn)曲線法(SCM)相比，QAMS法具有以下優(yōu)點(diǎn)：可反映中藥整體性質(zhì)量；克服中藥多組分含量測(cè)定時(shí)對(duì)照品缺乏的問(wèn)題[17]；由測(cè)定單一指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)向有效組分，從而解決了中藥多組分質(zhì)量控制的難題；通過(guò)相對(duì)校正因子減少測(cè)定結(jié)果對(duì)儀器穩(wěn)定性的依賴；對(duì)于中藥材等成分復(fù)雜、基質(zhì)干擾多的樣品可靠性高；可顯著降低檢測(cè)成本和時(shí)間等。筆者以雞內(nèi)金為研究對(duì)象，采用一測(cè)多評(píng)高效液相色譜法，以尿苷為內(nèi)參物，同時(shí)測(cè)定雞內(nèi)金中腺嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、肌苷、胸苷9種核苷類成分含量。該方法簡(jiǎn)便、實(shí)用，準(zhǔn)確度高，節(jié)約檢測(cè)成本，可為雞內(nèi)金質(zhì)量控制和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)等提供參考。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：LC-2030 PLUS型，配有PDA檢測(cè)器、Lab Solution工作站，日本島津公司。數(shù)控超聲波清洗器：KQ-600GDV型，昆山市超聲儀器有限公司。高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀有限公司。電子天平：MS204TS型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。超純水系統(tǒng)：Milli-Q Advantage A10型，美國(guó)密理博公司。對(duì)照品：腺嘌呤，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，批號(hào)為110886-202203；尿嘧啶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%，批號(hào)為100469-201302；次黃嘌呤，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%，批號(hào)為140661-202005；腺苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%，批號(hào)為110879-202204；尿苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%，批號(hào)為110887-202104；胸腺嘧啶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%，批號(hào)為140708-201902；鳥苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.6%，批號(hào)為111977-202202；肌苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%，批號(hào)為140669-202007；胸苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%，批號(hào)為101215-201401；中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、磷酸：均為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用其余試劑均為分析純。雞內(nèi)金樣品：市售，共10批，編號(hào)為S1～S10，經(jīng)濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心宋希貴主任中藥師鑒定為雉科動(dòng)物家雞Gallus gallus domesticus Brisson的干燥沙囊內(nèi)壁。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，技爾(上海)商貿(mào)有限公司]；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣體積：20 µL；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。

表1   梯度洗脫程序

Tab. 1   Gradient elution program

 

1.3 溶液配制

9種成分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取適量的腺嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、肌苷、胸苷對(duì)照品，加水溶解并稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.36、0.11、0.22、0.07、0.36、0.07、0.15、0.16、0.22 mg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密吸取適量的各單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于同一只10 mL容量瓶中，加水定容至標(biāo)線，混勻，得到9種成分質(zhì)量濃度均分別為36、11、22、7、35、6、14、14、20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.15、0.30、0.75、1.05、1.50、2.25、3.00 mL，分別置于3 mL容量瓶中，加水定容至標(biāo)線，搖勻，即得系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中9種核苷類成分的質(zhì)量濃度見(jiàn)表2。

表2   系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中9種成分的質(zhì)量濃度

Tab. 2   Mass concentration of 9 components in a series of mixed standard working solutions ( μg/mL )

 

1.4 樣品處理

取雞內(nèi)金樣品約2 g，精密稱量，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL水，稱量質(zhì)量。超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz) 40 min，冷卻至室溫，再次稱量質(zhì)量。加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

1.5 定量方法

取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 梯度淋洗程序優(yōu)化

參考醋雞內(nèi)金配方顆粒含量測(cè)定的液相色譜條件[11]，對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化。取9種成分單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照文獻(xiàn)[11]色譜條件及梯度淋洗程序分別平行測(cè)定6次，各色譜峰平均保留時(shí)間見(jiàn)表3。

表3   不同色譜條件下9種成分保留時(shí)間

Tab. 3   Retention times of nine components under different chromatographic conditions

 

由表3可知，9種成分保留時(shí)間集中于5～25 min范圍內(nèi)，將15～55 min時(shí)間段調(diào)整為15～35 min，同時(shí)將該時(shí)段流量調(diào)整為0.8～0.9 mL/min，并在35 min后繼續(xù)沖洗5 min，使流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)恢復(fù)到初始值。優(yōu)化后洗脫效果不變，基線平穩(wěn)，色譜峰型良好，但總洗脫時(shí)間減少20 min，單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各色譜峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，可用于雞內(nèi)金中9種核苷類成分的測(cè)定。優(yōu)化后的梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2 專屬性試驗(yàn)

按照1.2色譜條件，分別對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，樣品溶液中9種成分的色譜峰保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液相對(duì)應(yīng)，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)(按各成分色譜峰計(jì))均大于5 000，表明該方法專屬性良好。

圖1   混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液色譜圖

Fig. 1   Chromatograms of mixed standard working solution and sample solution

2.3 線性方程與定量限

按照1.2色譜條件，分別對(duì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程及相關(guān)系數(shù)。取1#混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用水逐級(jí)稀釋，按1.2色譜條件測(cè)定，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為儀器檢出限和定量限，根據(jù)樣品質(zhì)量和定容體積換算為方法檢出限和定量限，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/g)表示。9種成分的線性范圍(質(zhì)量濃度)、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表4。由表4可知，9種成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 8。

表4   線性范圍(質(zhì)量濃度)、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

Tab. 4   Linear ranges ( mass concentration )，linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits

 

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取編號(hào)為S3的樣品，按1.4方法制備樣品溶液，分別于第0、3、6、9、12、24、36 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，各成分色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.42%～1.3%，表明樣品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5   穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 5   Stability test results

 

2.5 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

取編號(hào)為S3的樣品6份，每份約1 g，精密稱定，分別向每份樣品中精密加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4方法制備加標(biāo)樣品溶液，并在1.2色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，樣品加標(biāo)平均回收率為95.8%～103%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%～0.85%。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表6   樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 6   Results of samples recovery and precision test

 

2.6 一測(cè)多評(píng)法的建立

2.6.1 內(nèi)參物的選擇

由混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液色譜圖可知，尿苷色譜峰位于中間位置，色譜峰面積較大，分離度良好，且在所有樣品中均存在，因此選擇尿苷為內(nèi)參物。

2.6.2 相對(duì)校正因子的計(jì)算

根據(jù)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定結(jié)果，以尿苷為內(nèi)參物，按式(1)計(jì)算其他成分相對(duì)于尿苷的校正因子：

式中：fk——成分k的相對(duì)校正因子；mk——成分k的質(zhì)量，μg；As——內(nèi)參物的色譜峰面積；ms——內(nèi)參物的質(zhì)量，μg；Ak——成分k的色譜峰面積。計(jì)算得腺嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、鳥苷、肌苷、胸苷的平均相對(duì)校正因子依次為0.393、0.447、0.390、0.525、0.780、0.824、0.881、1.326，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.468%、0.266%、0.087%、0.808%、1.041%、0.204%、0.319%、0.414%(n=7)。

2.6.3 目標(biāo)組分色譜峰的定位

采用相對(duì)保留時(shí)間(RRT)進(jìn)行定位。記錄S1～S10樣品色譜圖中9種成分的保留時(shí)間，以尿苷的保留時(shí)間為基準(zhǔn)(即相對(duì)保留時(shí)間為1)，計(jì)算其他8種成分的相對(duì)保留時(shí)間。腺嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、鳥苷、肌苷、胸苷相對(duì)保留時(shí)間分別為0.318、0.488、0.552、0.866、1.154、1.235、1.312、1.542，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.219%、1.152%、1.160%、1.019%、1.160%、1.156%、1.202%、1.154%(n=10)。表明利用目標(biāo)成分與內(nèi)參物的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定位的方法可行，并且對(duì)不同廠家或者產(chǎn)地的雞內(nèi)金普遍適用。

2.7 一測(cè)多評(píng)法耐用性考察

分別對(duì)4種色譜柱、3個(gè)品牌儀器、4種不同柱溫進(jìn)行試驗(yàn)，考察不同條件對(duì)相對(duì)校正因子及相對(duì)保留時(shí)間的影響。以尿苷為內(nèi)參物(即RCF和RRT均為1)，f1～f8分別為不同條件下腺嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、鳥苷、肌苷、胸苷的相對(duì)校正因子，t1～t8分別為不同條件下8種成分的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表7～表10。

表7   不同儀器和色譜柱時(shí)的相對(duì)校正因子

Tab. 7   Relative correction factors for different instruments and chromatographic columns

 

表8   不同柱溫時(shí)的相對(duì)校正因子

Tab. 8   Relative correction factors at different column temperatures

 

表9   不同儀器時(shí)的相對(duì)保留時(shí)間

Tab. 9   Relative retention time for different instruments

 

表10   不同柱溫時(shí)的相對(duì)保留時(shí)間

Tab. 10   Relative retention time for different column temperatures

 

根據(jù)表7～表10數(shù)據(jù)，計(jì)算不同儀器和色譜柱時(shí)f1～f8的RSD分別為2.32%、2.30%、2.93%、2.08%、1.38%、1.49%、1.65%、1.50%（n=12）；不同柱溫時(shí)f1～f8的RSD分別為1.15%、2.10%、1.76%、1.55%、0.76%、1.24%、1.08%、0.82%（n=4）。不同儀器時(shí)t1～t8的RSD分別為2.41%、1.98%、1.63%、1.16%、0.92%、5.43%、0.95%、0.56%（n=3）；不同柱溫時(shí)t1～t8的RSD分別為1.03%、1.38%、2.03%、1.25%、1.56%、5.53%、0.87%、0.74%（n=4）。表明不同儀器、色譜柱和柱溫對(duì)8種成分的相對(duì)校正因子及相對(duì)保留時(shí)間影響較小。

2.8 比對(duì)試驗(yàn)

分別采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法對(duì)編號(hào)為S1～S10的樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表11。根據(jù)表11數(shù)據(jù)，計(jì)算兩種方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差均小于3%。表明所建立的一測(cè)多評(píng)法可用于雞內(nèi)金中9種成分的同時(shí)測(cè)定。

表11   外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果

Tab. 11   Determination results of external standard method and quantitative analysis of multi-components with a single marker method ( μg/g )

 

3 結(jié)論

(1) 利用一測(cè)多評(píng)液相色譜法，以尿苷作為內(nèi)參物，采用相對(duì)保留時(shí)間定位，成功定位其他8種成分，并借助相對(duì)校正因子進(jìn)行了9種核苷類成分的準(zhǔn)確測(cè)定。(2) 所選取的9種核苷類成分在雞內(nèi)金中普遍存在，且存在關(guān)聯(lián)性，可應(yīng)用于雞內(nèi)金質(zhì)量控制。(3) 10批樣品中，各成分之間含量差異較大，應(yīng)根據(jù)《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，對(duì)藥用雞內(nèi)金的生產(chǎn)規(guī)程進(jìn)行規(guī)范，針對(duì)現(xiàn)行雞內(nèi)金質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不足，應(yīng)增加核苷類成分含量測(cè)定項(xiàng)目。(4) 建立的QAMS法簡(jiǎn)便、實(shí)用，測(cè)定目標(biāo)成分種類多且準(zhǔn)確度高，可顯著降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率。

 

參考文獻(xiàn)

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