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摘 要： 建立一種測(cè)定水中地西泮殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。水樣經(jīng)定性濾紙過(guò)濾，選擇Oasis HLB固相萃取柱進(jìn)行富集凈化，用Eclipse Plus C18（150.0 mm×2.1 mm，3.5 μm）色譜柱分離，以甲醇和0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，用內(nèi)標(biāo)法定量。地西泮的質(zhì)量濃度在0.05～20 μg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。方法檢出限、定量限分別為2、5 ng/L。樣品加標(biāo)平均回收率為96.1%～117%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%～7.1%（n=6）。該方法操作簡(jiǎn)單，滿(mǎn)足養(yǎng)殖水體中地西泮的測(cè)定要求。

 

關(guān)鍵詞： 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法； 固相萃取； 地西泮； 養(yǎng)殖水； 內(nèi)標(biāo)法

 

地西泮屬于苯二氮卓類(lèi)藥物，是臨床常用緩解急性焦慮的藥物之一，具有治療失眠，抗焦慮的作用[1?2]，但是該藥有一定的潛在成癮性和依賴(lài)性[3]。近年來(lái)，地西泮被非法用作動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑，并通過(guò)食物鏈對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成危害[4]。GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)　食品中獸藥最大殘留限量》明確規(guī)定，地西泮可用于動(dòng)物治療，但禁止在飼料和飲水中添加，且在動(dòng)物性食品中不得檢出?！东F藥管理?xiàng)l例》[5]及《關(guān)于發(fā)布<水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1、2號(hào)>宣傳材料的通知》[6]亦明確禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用地西泮。

 

近年來(lái)，針對(duì)地西泮在水產(chǎn)品、魚(yú)用餌料以及環(huán)境中的殘留研究迅速開(kāi)展，鄭皓潔等[7]、楚瀚等[8]、王旭峰等[9]發(fā)現(xiàn)水體中存在地西泮污染，其來(lái)源包括人類(lèi)和動(dòng)物排泄物排放、非法用作水產(chǎn)垂釣的麻醉劑。地西泮半衰期較長(zhǎng)，易在環(huán)境中富集。白淑艷等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚(yú)長(zhǎng)期暴露于含有地西泮的水體中，體內(nèi)會(huì)快速富集且難以降解。水產(chǎn)品中地西泮藥物殘留與養(yǎng)殖水環(huán)境直接相關(guān)，水環(huán)境污染是導(dǎo)致地西泮殘留的重要因素。

 

目前，地西泮的主要檢測(cè)方法有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[11?12]、高效液相色譜法[13]、酶聯(lián)免疫分析法[14]等。其中，HPLC-MS/MS法具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是動(dòng)物源性食品、水體等樣品常用的分析手段。筆者采用HPLC-MS/MS結(jié)合Oasis HLB固相萃取柱測(cè)定養(yǎng)殖水中的地西泮，通過(guò)對(duì)比不同固相萃取柱的凈化效果，選擇Oasis HLB柱(兼具反相保留與極性吸附能力)進(jìn)行富集；考慮到水體中地西泮含量極低，對(duì)水樣進(jìn)行濃縮，并采用內(nèi)標(biāo)法減少誤差；同時(shí)對(duì)儀器分析條件和樣品處理方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。該方法可為養(yǎng)殖水中地西泮的測(cè)定提供技術(shù)支撐。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Triple Quad 450型，美國(guó)Sciex公司。氮吹儀：MFV-3型，廣州得泰儀器科技有限公司。智能超純水機(jī)：Classic EU10型，青島普洛斯科技有限公司。固相萃取裝置：HyperSe型，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。真空泵：VP50型，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。多樣品渦旋混合器：Multivortex型，廣州得泰儀器科技有限公司。Oasis HLB固相萃取柱：60 mg，3 mL，美國(guó)沃特世公司。定性濾紙：杭州特種紙業(yè)有限公司。地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 mg/L，產(chǎn)品編號(hào)為91274GA，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。地西泮-D5同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 mg/L，產(chǎn)品編號(hào)為91293GA，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。甲醇、乙腈：均為色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司。甲酸：色譜純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99%，美國(guó)ACS公司。氨水：分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)(NH3)為25%～28%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水樣品：于養(yǎng)殖區(qū)域現(xiàn)場(chǎng)采集。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》中一級(jí)水要求。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：Eclipse plus C18柱(150 mm ×2.1 mm，3.5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇，流量為0.3 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～1 min時(shí)A相體積分?jǐn)?shù)為90%，1～9 min時(shí)A相體積分?jǐn)?shù)由90%逐漸降低至10%，9～12 min時(shí)A相體積分?jǐn)?shù)為10%，12～12.5 min時(shí)A相體積分?jǐn)?shù)由10%逐漸增加至90%。

1.2.2 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧離子源，正離子模式；離子源溫度：500 ℃；離子噴霧電壓：+5 500 V；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；碰撞氣：氮?dú)猓瑝毫?2 kPa；氣簾氣：氮?dú)?，壓力?76 kPa；噴霧氣：空氣，壓力為379 kPa；加熱輔助氣：空氣，壓力為379 kPa。地西泮和地西泮-D5的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1   地西泮和地西泮-D5的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)

Tab. 1   Retention time and mass spectrometry parameters of diazepam and diazepam-D5

注：標(biāo)*的為定量離子。

 

1.3 溶液配制

80%乙腈溶液：移取80 mL乙腈與20 mL水混合均勻。標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別量取適量地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液和地西泮-D5同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋?zhuān)謩e配制成質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的地西泮標(biāo)準(zhǔn)貯備液和地西泮-D5標(biāo)準(zhǔn)貯備液。標(biāo)準(zhǔn)使用液：量取適量地西泮標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇稀釋?zhuān)渲瞥?.1 μg/mL地西泮標(biāo)準(zhǔn)使用液。地西泮系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：用移液器分別吸取適量地西泮標(biāo)準(zhǔn)使用液和地西泮-D5標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用80%乙腈溶液稀釋?zhuān)渲瞥傻匚縻馁|(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中地西泮-D5內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為5 μg/L。

1.4 樣品處理

水樣用定性濾紙經(jīng)布氏漏斗進(jìn)行真空抽濾，除去水中的難溶性雜質(zhì)。準(zhǔn)確量取100 mL過(guò)濾后的水樣，加入5 μL地西泮-D5標(biāo)準(zhǔn)貯備液，混勻，通過(guò)Oasis HLB柱進(jìn)行凈化。HLB柱使用前用6 mL甲醇和6 mL超純水進(jìn)行活化，控制流量為6 mL/min。用5 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液淋洗，用真空泵抽干剩余淋洗液。將8 mL甲醇分2次(每次4 mL)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在40 ℃氮?dú)饬飨麓蹈?，?0%乙腈溶液定容至1 mL，經(jīng)30 s渦旋后，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液即為樣品溶液。以超純水代替水樣，同法制備空白樣品溶液。

1.5 測(cè)定方法

按1.2儀器工作條件測(cè)定地西泮系列標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度比值(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算水樣中地西泮的質(zhì)量濃度。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別取適量地西泮標(biāo)準(zhǔn)使用液及地西泮-D5標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用50% (體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液稀釋?zhuān)蛊滟|(zhì)量濃度均為100 μg/L。在正離子模式下，選擇全掃描模式，分別對(duì)上述溶液進(jìn)行掃描，確定地西泮和地西泮-D5的分子離子峰及質(zhì)荷比，以分子離子峰作為母離子，在子離子掃描模式下，手動(dòng)調(diào)節(jié)碰撞能量，使母離子的強(qiáng)度為圖譜中基峰強(qiáng)度的1/3～1/4，此時(shí)選取響應(yīng)最高的碎片離子作為地西泮的定量子離子，選取響應(yīng)較高的碎片離子作為定性子離子，地西泮-D5只取定性離子，組建離子對(duì)，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)采集模式下，優(yōu)化碰撞電壓和去簇電壓等質(zhì)譜條件，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

地西泮化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有1，4-苯二氮的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，電離時(shí)苯二氮基團(tuán)易在正離子模式下產(chǎn)生M+H峰[15]。在流動(dòng)相中加入酸，可以增強(qiáng)正離子模式下目標(biāo)物的電離強(qiáng)度。有機(jī)相的種類(lèi)及其與水相的比例均會(huì)影響地西泮的出峰情況。SN/T 3235—2012《出口動(dòng)物源食品中多類(lèi)禁用藥物殘留量檢測(cè)方法　液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》和文獻(xiàn)[16]中均采用0.1%甲酸溶液和甲醇作為流動(dòng)相，筆者選用Eclipse Plus C18柱(150.0 mm×2.1 mm，3.5 μm)作為分析柱，有機(jī)相選擇甲醇，水相選擇0.1%甲酸溶液，對(duì)流動(dòng)相洗脫梯度、流量進(jìn)行優(yōu)化，得到色譜峰形對(duì)稱(chēng)、靈敏度較高的色譜條件(見(jiàn)1.2.1)。在優(yōu)化的色譜條件下，空白水樣和地西泮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(質(zhì)量濃度為0.05 μg/L)的選擇離子色譜圖分別如圖1和圖2所示。

圖1   空白水樣選擇離子色譜圖

Fig. 1   Select ion chromatogram of blank water sample

（a） m/z 285.1、193.1?。╞） m/z 285.1、154.1?。╟） m/z 290.1、198.1

圖2   地西泮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液選擇離子色譜圖

Fig. 2   Select ion chromatogram of diazepam standard working solution

（a） m/z 285.1、193.1（b） m/z 285.1、154.1?。╟） m/z 290.1、198.1

2.3 固相萃取柱選擇

張靜波等[17]對(duì)比了定性濾紙與0.45 μm玻璃纖維濾膜的過(guò)濾效果，發(fā)現(xiàn)二者差異不大，故選用定性濾紙過(guò)濾水樣。在水樣處理過(guò)程中，關(guān)鍵步驟是對(duì)水樣進(jìn)行凈化富集，最常用的凈化方法是固相萃取。HLB固相萃取柱的填料是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，通過(guò)反相保留機(jī)制增強(qiáng)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的吸附，尤其對(duì)堿性化合物具有顯著的吸附能力； MCX固相萃取柱的填料為聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，是一種兼具陽(yáng)離子交換與反相保留功能的吸附劑，對(duì)堿性目標(biāo)物具有較高的選擇性與靈敏度； MAX固相萃取柱的填料是將季銨基鍵合到高度交聯(lián)的PS/DVB表面得到的混合型強(qiáng)陰離子交換吸附劑，可與極性化合物形成較強(qiáng)的相互作用。地西泮屬于堿性且中等極性的化合物，因此選擇HLB、MCX和MAX 3種固相萃取柱進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)?？紤]到不同地區(qū)養(yǎng)殖水的pH值存在差異，通過(guò)加入甲酸或氨水將水樣pH值分別調(diào)節(jié)至3.0、6.0、7.0、8.0、10.0，考察不同酸堿度下上述3種固相萃取柱對(duì)地西泮的凈化效果。具體操作如下：在100 mL空白水樣中，加入地西泮標(biāo)準(zhǔn)使用液和地西泮-D5標(biāo)準(zhǔn)貯備液，使地西泮的最終質(zhì)量濃度為100 ng/L，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為5 μg/L，調(diào)節(jié)溶液pH值后，分別采用3種固相萃取柱進(jìn)行凈化濃縮，按1.2儀器工作條件測(cè)定，每種固相萃取柱進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，以平均值作為測(cè)定值，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，在酸性條件下(pH=3)，利用MCX柱和MAX柱凈化時(shí)，地西泮的回收率較低(均小于80%)；在pH值為6～10的范圍內(nèi)，利用MCX柱和MAX柱凈化時(shí)，地西泮的回收率均大于87%；而HLB柱基本不受溶液pH值的影響，且回收率均大于93%，因此選擇Oasis HLB固相萃取柱。

圖3   不同pH值下3種固相萃取柱凈化的回收率

Fig. 3   Recoveries of three solid-phase extraction columns purified at different pH values

2.4 淋洗液和洗脫液選擇

分別用純水以及體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、15%、20%的甲醇溶液淋洗HLB固相萃取柱，淋洗液中均未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物，表明以純水和較低濃度的甲醇溶液作為淋洗液時(shí)，地西泮均能穩(wěn)定地保留在固相萃取柱上。在淋洗液中加入適量甲醇能夠去除液體中非極性干擾物，水是一種極性較強(qiáng)的溶劑，養(yǎng)殖水體中非極性干擾物較少，因此選擇體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇溶液作為淋洗液。地西泮易溶于有機(jī)溶劑，分別采用8 mL甲醇和8 mL乙腈洗脫HLB固相萃取柱，地西泮的回收率分別為96.1%、93.4% (n=3)，表明甲醇和乙腈對(duì)地西泮均具有較強(qiáng)的洗脫能力，使用甲醇洗脫時(shí)地西泮的回收率稍大于乙腈，故選擇甲醇作為洗脫液。

2.5 洗脫液體積選擇

分別收集第1～5 mL、第6～8 mL、第9～11 mL洗脫液，經(jīng)氮吹濃縮后，用1 mL 80%乙腈溶液復(fù)溶，按1.2儀器工作條件測(cè)定，考察洗脫液體積對(duì)洗脫效果的影響，結(jié)果如圖4～圖6所示。由圖5和圖6可以看出，在第6～8 mL洗脫液中仍有地西泮檢出，而在第9～11 mL洗脫液中地西泮及其內(nèi)標(biāo)的信號(hào)均較小，幾乎看不到，可見(jiàn)用8 mL甲醇洗脫HLB固相萃取柱可以達(dá)到較好的洗脫效果。

圖4   第1～5 mL洗脫液中選擇離子色譜圖

Fig. 4   Select ion chromatogram for 1st to 5th mL eluent

（a） m/z 285.1、193.1（b） m/z 285.1、154.1（c） m/z 290.1、198.1

圖5   第6～8 mL洗脫液中選擇離子色譜圖

Fig. 5   Select ion chromatogram for the 6th to 8th mL eluent

（a） m/z 285.1、193.1?。╞） m/z 285.1、154.1?。╟） m/z 290.1、198.1

圖6   第9～11 mL洗脫液中選擇離子色譜圖

Fig. 6   Select ion chromatogram for the 9th to 11th mL eluent

（a） m/z 285.1、193.1（b） m/z 285.1、154.1　?。╟） m/z 290.1、198.1

2.6 線(xiàn)性方程與檢出限、定量限

按1.2儀器工作條件測(cè)定地西泮系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，計(jì)算得線(xiàn)性方程為y=1.539 53x+0.004 14，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。表明地西泮的質(zhì)量濃度在0.05～20 μg/L范圍內(nèi)與色譜峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。采用空白樣品標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行測(cè)定，分別以3倍和10倍定量離子信噪比確定方法的檢出限和定量限，得方法檢出限為2 ng/L，定量限為5 ng/L。

2.7 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

在超純水中加入適量地西泮標(biāo)準(zhǔn)使用液和地西泮-D5標(biāo)準(zhǔn)貯備液，使地西泮的最終質(zhì)量濃度分別10.0、50.0、100.0 ng/L，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為5 μg/L，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)濃度水平平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，地西泮的平均回收率為96.1%～117%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%～7.1%。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，滿(mǎn)足養(yǎng)殖水中地西泮的測(cè)定要求。

表2   樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 2   Results of samples spiked recovery and precision test

 

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

在室溫條件下，在空白養(yǎng)殖水中加入適量地西泮標(biāo)準(zhǔn)使用液和地西泮-D5標(biāo)準(zhǔn)貯備液，按1.4進(jìn)行樣品處理，按1.2儀器工作條件，分別在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，13次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%，表明在20天考察時(shí)間內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性良好。

表3   溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 3   Solution stability test results

 

3 結(jié)論

(1) 建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定養(yǎng)殖水中地西泮的分析方法。選擇HLB柱富集凈化樣品，以5%甲醇溶液為淋洗液，以甲醇為洗脫液，當(dāng)養(yǎng)殖水樣品為100 mL時(shí)，洗脫液體積為8 mL。在養(yǎng)殖水pH=3.0～10.0范圍內(nèi)，該方法具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度。(2) 該方法對(duì)pH要求較低，在樣品處理過(guò)程中不用調(diào)節(jié)pH值，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)程序，滿(mǎn)足養(yǎng)殖水體中地西泮的檢測(cè)要求。(3) 在自然條件下，養(yǎng)殖水中地西泮比較穩(wěn)定，難以降解，對(duì)水體污染和水產(chǎn)品質(zhì)量安全造成潛在風(fēng)險(xiǎn)，建議進(jìn)一步對(duì)地西泮降解方法進(jìn)行研究，以減輕甚至消除地西泮的污染，確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

 

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6 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部.關(guān)于發(fā)布《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1、2號(hào)》宣傳材料的通知［EB/OL］.（2022-11-15）2025-06-21］. http：//www.yyj.moa.gov.cn/gzdt/202211/t20221115 6415528.html.
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17 張靜波，王雨琪，徐匯宏，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖水體地西泮方法的優(yōu)化及穩(wěn)定性［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2024，45（8）： 7.
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