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剛剛，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心發(fā)布《腫瘤伴隨診斷相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑（實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法）注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2025年修訂版）》，全文如下：

 

腫瘤伴隨診斷相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑（實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法）注冊(cè)審查指導(dǎo)原則

（2025年修訂版）

 

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)腫瘤伴隨診斷相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)腫瘤伴隨診斷相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評(píng)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究和驗(yàn)證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

 

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于基于實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Real time PCR）方法的核酸檢測(cè)技術(shù)，以腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因變異為檢測(cè)目標(biāo)，對(duì)人體樣本（包括組織、體液等）提取的核酸組分中的目標(biāo)序列進(jìn)行體外檢測(cè)的試劑。

本指導(dǎo)原則所指基因突變的類(lèi)型包括置換、插入、缺失、融合基因、拷貝數(shù)異常及核糖核酸（RNA）表達(dá)異常等廣義的基因突變，不包含腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法確立的，對(duì)于高分辨熔解曲線PCR方法、核酸檢測(cè)芯片、數(shù)字PCR等其他基于PCR的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本指導(dǎo)原則所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)實(shí)際產(chǎn)品特性選擇適合的方法或補(bǔ)充需要的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證其科學(xué)合理性，同時(shí)確認(rèn)性能評(píng)價(jià)的充分性。本指導(dǎo)原則所涉及試劑的方法學(xué)不包括熒光原位雜交（Fluorescence in situ Hybridization，F(xiàn)ISH）、核酸序列測(cè)定（如不包括二代測(cè)序、焦磷酸測(cè)序等）等用于伴隨診斷基因變異檢測(cè)的其他方法學(xué)。

對(duì)于伴隨診斷試劑，其與治療藥物具有關(guān)聯(lián)性，申請(qǐng)人需結(jié)合突變基因檢測(cè)與治療藥物預(yù)期用途所限定的癌癥類(lèi)型進(jìn)行聯(lián)合評(píng)價(jià)研究。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行注冊(cè)申報(bào)和變更注冊(cè)的產(chǎn)品。本指導(dǎo)原則針對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫(xiě)，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等法規(guī)要求及其他伴隨診斷相關(guān)指導(dǎo)原則要求。

 

二、注冊(cè)審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱(chēng)及分類(lèi)編碼

產(chǎn)品名稱(chēng)應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求。按照《體外診斷試劑分類(lèi)規(guī)則》，該產(chǎn)品為第三類(lèi)體外診斷試劑，分類(lèi)編碼為6840。

2.申請(qǐng)人還需提交產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說(shuō)明的內(nèi)容。其中同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)、不同基因突變類(lèi)型檢出能力及腫瘤個(gè)體化治療藥物、適用人群及臨床意義等方面寫(xiě)明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若尚無(wú)同品種批準(zhǔn)上市，則應(yīng)詳細(xì)論述作為檢測(cè)靶標(biāo)的基因變異與腫瘤治療藥物的相關(guān)性，說(shuō)明科學(xué)依據(jù)。

提交的資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《辦法》）和《體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求及說(shuō)明》的相關(guān)要求。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告

按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求編寫(xiě)產(chǎn)品技術(shù)要求，并提交三個(gè)不同批次符合產(chǎn)品技術(shù)要求的全項(xiàng)目檢驗(yàn)報(bào)告。提交資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求及說(shuō)明》《醫(yī)療器械自檢管理規(guī)定》等相關(guān)文件的要求。

2.分析性能研究

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料和生產(chǎn)工藝經(jīng)過(guò)選擇和確認(rèn)、質(zhì)量管理體系得到有效控制并且保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，采用完整、確定的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分析性能評(píng)估。

對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、研究方法、試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、采用的試劑名稱(chēng)、規(guī)格和批號(hào)，儀器名稱(chēng)和型號(hào)，樣本類(lèi)型和來(lái)源等。分析性能評(píng)估的試驗(yàn)方法可以參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。若試劑用于RNA樣本檢測(cè)，則在性能評(píng)估中（除非特別說(shuō)明）需對(duì)所有突變位點(diǎn)均采用RNA樣本，從而對(duì)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行驗(yàn)證。

如申報(bào)產(chǎn)品適用不同的機(jī)型，需要提交采用不同機(jī)型進(jìn)行性能評(píng)估的資料。如申報(bào)產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對(duì)各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗(yàn)證。

對(duì)于需要研究的變異位點(diǎn)，應(yīng)全面評(píng)估聲稱(chēng)可檢測(cè)的變異類(lèi)型及變異位點(diǎn)。對(duì)于可選擇代表性位點(diǎn)的情形，應(yīng)選擇涵蓋不同的反應(yīng)單元、不同的反應(yīng)體系、不同的引物探針覆蓋序列以及常見(jiàn)或者重要的變異基因位點(diǎn)進(jìn)行研究。對(duì)于野生型基因組DNA是指與被測(cè)基因變異位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的野生型基因組DNA。

建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。

2.1樣本穩(wěn)定性

樣本穩(wěn)定性研究主要包括樣本提取前核酸序列的穩(wěn)定性和樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性?xún)煞矫?。申?qǐng)人應(yīng)建立樣本核酸提取評(píng)價(jià)的具體要求。此外對(duì)于可冷凍樣本，如適用，申請(qǐng)人應(yīng)評(píng)價(jià)提取前、提取后凍融次數(shù)、儲(chǔ)存條件等因素。在長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，應(yīng)在使用前采用合理方法評(píng)價(jià)腫瘤組織/腫瘤細(xì)胞含量、核酸濃度、純度、核酸完整性或降解程度。如果包括多種樣本類(lèi)型，則需分別完成相關(guān)研究。

2.1.1樣本提取前核酸序列的穩(wěn)定性

對(duì)于經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋組織切片樣本，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)組織樣本保存溫度，保存年限進(jìn)行限定。建議明確組織切片樣本的規(guī)范采集標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證不同時(shí)間段保存的組織樣本對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

對(duì)于新鮮冰凍切片樣本，應(yīng)限定新鮮冰凍切片樣本檢測(cè)時(shí)限，明確新鮮冰凍切片的切片要求。

對(duì)于外周血樣本，外周血采集后，應(yīng)對(duì)外周血存放條件、存放時(shí)限及溫度設(shè)置等進(jìn)行驗(yàn)證，包括采用抗核酸降解或防細(xì)胞裂解采血管的要求。采樣所用的防腐劑、抗凝劑、保護(hù)劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)過(guò)程造成干擾。申請(qǐng)人還需對(duì)抗凝劑、防腐劑、保護(hù)劑等成分進(jìn)行驗(yàn)證。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)外周血樣本保存時(shí)間及溫度、離心參數(shù)設(shè)置等進(jìn)行驗(yàn)證。

對(duì)于以循環(huán)游離DNA（cfDNA，cell free DNA）為檢測(cè)物質(zhì)的試劑，血漿和血清中cfDNA的檢出率可能存在差異。在標(biāo)本的采集、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過(guò)程中，防止游離DNA的降解是首要考慮的因素。其次，也應(yīng)防止血液中白細(xì)胞的裂解，避免因野生型DNA的增加導(dǎo)致cfDNA中的基因變異無(wú)法檢測(cè)。

2.1.2樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性

對(duì)于組織樣本，應(yīng)檢測(cè)核酸的含量，設(shè)置反應(yīng)體系需要的核酸含量上限和下限。設(shè)置反應(yīng)體系所需初始DNA含量范圍，如單位體積DNA濃度超過(guò)所需濃度上限或下限，應(yīng)提供相應(yīng)的改進(jìn)措施。對(duì)于外周血樣本，應(yīng)檢測(cè)核酸的含量，設(shè)置反應(yīng)體系所需初始DNA含量范圍，如單位體積DNA濃度低于所需濃度，應(yīng)提供相應(yīng)的改進(jìn)措施。同時(shí)，應(yīng)對(duì)核酸提取物的保存時(shí)間，保存溫度進(jìn)行驗(yàn)證。并評(píng)價(jià)凍融次數(shù)、儲(chǔ)存條件等對(duì)樣本提取后核酸序列穩(wěn)定性的影響。此外應(yīng)采用合理方法對(duì)樣本提取后核酸序列評(píng)價(jià)其純度。

2.1.3樣本完整性

在樣本提取前、提取過(guò)程、提取后以及在儲(chǔ)存期間，核酸會(huì)發(fā)生不同程度地降解。為使降解降低到最低程度（提取前或提取后），應(yīng)避免樣品的多次冷凍/融化。必要時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)評(píng)價(jià)提取前、提取后凍融次數(shù)、儲(chǔ)存條件等因素。在長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后，應(yīng)在使用前評(píng)價(jià)核酸的完整性。比較檢測(cè)結(jié)果與儲(chǔ)存前檢測(cè)結(jié)果的一致性，如采用瓊脂糖凝膠電泳或者內(nèi)參基因PCR檢測(cè)等方法。

2.2適用的樣本類(lèi)型

明確適用的樣本類(lèi)型。病理組織切片需明確組織、腫瘤等信息。

如果試劑適用于多種樣本類(lèi)型，應(yīng)采用合理方法評(píng)價(jià)每種樣本類(lèi)型及添加劑的適用性。對(duì)具有可比性的樣本類(lèi)型，可選擇具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的樣本進(jìn)行樣本一致性的同源比對(duì)研究；對(duì)于不具有可比性的樣本類(lèi)型，應(yīng)對(duì)每種樣本類(lèi)型分別進(jìn)行分析性能評(píng)估。如若試劑盒適用的樣本類(lèi)型既包含石蠟包埋組織切片亦包含冷凍組織切片或血液樣本等，則需對(duì)所有樣本類(lèi)型的適用性進(jìn)行評(píng)估，并提交評(píng)估資料。對(duì)于來(lái)源不同部位的相同樣本類(lèi)型的樣本，應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途、產(chǎn)品特性等進(jìn)行充分評(píng)價(jià)。

如果樣本的采集、處理方式存在差別，例如適用不同采樣器、不同樣本保存液、不同處理方法（如核酸的提取與純化、組織切片處理等），應(yīng)分析這些差別的潛在影響，并進(jìn)行針對(duì)性的分析性能驗(yàn)證。對(duì)于檢測(cè)外周血cfDNA的試劑，應(yīng)明確配套使用的采血管的要求。采樣所用的防腐劑、抗凝劑、保護(hù)劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)過(guò)程造成干擾。申請(qǐng)人還需對(duì)抗凝劑、防腐劑、保護(hù)劑等成分進(jìn)行驗(yàn)證。

申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合配套的核酸提取試劑以及檢出限性能研究，對(duì)滿足性能要求的最低腫瘤組織占比/腫瘤細(xì)胞比例進(jìn)行研究，需明確腫瘤細(xì)胞組成、數(shù)量的確定方法。例如，對(duì)于病理組織學(xué)樣本類(lèi)型，如福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE），對(duì)腫瘤組織占比進(jìn)行研究，確定滿足性能指標(biāo)要求的最少腫瘤組織比例。

2.3準(zhǔn)確度

申請(qǐng)人可采用以下兩種方法之一對(duì)基因變異的檢出能力進(jìn)行準(zhǔn)確度研究。一種方法是方法學(xué)比對(duì)，采用申報(bào)試劑與標(biāo)準(zhǔn)方法（或參考方法）或同類(lèi)已上市產(chǎn)品，同時(shí)檢測(cè)同一批臨床樣本，比較檢測(cè)結(jié)果之間的一致性程度；另一種方法是通過(guò)檢測(cè)參考品/參考盤(pán)分析申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果與經(jīng)確認(rèn)結(jié)果的符合情況，評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品的準(zhǔn)確度。

應(yīng)采用一定數(shù)量臨床樣本驗(yàn)證該類(lèi)產(chǎn)品的檢測(cè)準(zhǔn)確性，并提供樣本例數(shù)的確定依據(jù)，根據(jù)檢測(cè)位點(diǎn)多少，采用相應(yīng)數(shù)量的臨床陽(yáng)性樣本進(jìn)行研究。樣本類(lèi)型與說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)的樣本類(lèi)型一致，應(yīng)包含所有突變類(lèi)型及突變位點(diǎn)。同時(shí)建議考察對(duì)復(fù)合突變樣本/人工構(gòu)建質(zhì)粒的檢出能力。

提供所有試驗(yàn)用樣本來(lái)源、基因突變、型別確認(rèn)等試驗(yàn)資料。

2.4企業(yè)參考品檢驗(yàn)

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用至少三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.5精密度

應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計(jì)合理的精密度試驗(yàn)方案進(jìn)行評(píng)價(jià)。精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如為期至少20天的檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度、實(shí)驗(yàn)室間精密度、批間精密度等結(jié)果。具體方案可參考性能評(píng)價(jià)相關(guān)文件進(jìn)行。精密度評(píng)價(jià)應(yīng)盡量采用臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)于難以獲取的濃度，可采用不同濃度的樣本及陰性樣本進(jìn)行混合，對(duì)于特定難以獲取的突變類(lèi)型，可適當(dāng)采用人工制備的樣本。試驗(yàn)操作完全按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行，包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。

用于精密度評(píng)價(jià)的樣本應(yīng)考慮腫瘤伴隨診斷相關(guān)基因的常見(jiàn)變異位點(diǎn)及所有變異類(lèi)型的臨床樣本，并應(yīng)包含每一反應(yīng)單元易錯(cuò)或代表性的樣本。應(yīng)闡述研究位點(diǎn)選擇依據(jù)，明確樣本的來(lái)源、濃度和性質(zhì)確定方法。設(shè)置至少低濃度和中/高濃度兩個(gè)水平，并分別至少設(shè)置高低兩種突變頻率。建議同時(shí)對(duì)陰性樣本進(jìn)行驗(yàn)證。如果試劑盒可以覆蓋多個(gè)變異位點(diǎn)的檢測(cè)，申請(qǐng)人可以對(duì)全部變異位點(diǎn)進(jìn)行精密度驗(yàn)證，也可以選擇其中部分變異位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，但應(yīng)至少包含常見(jiàn)變異序列或理論上較難測(cè)得的變異序列。如果待測(cè)物靶核酸為RNA，則弱陽(yáng)性樣本中應(yīng)至少包含常見(jiàn)主要變異位點(diǎn)。

2.6檢出限

注冊(cè)人應(yīng)對(duì)試劑盒所覆蓋的可檢測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)限的研究。應(yīng)包括檢出限確定和驗(yàn)證研究資料。擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的變異序列百分率和總核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)最低檢測(cè)限的影響較大，終體系中變異序列的百分率越高、所含的DNA（RNA）量越多，則越容易檢出。因此，試劑盒最低檢測(cè)限主要考慮以下兩種情形。

2.6.1在擴(kuò)增反應(yīng)終體系特定核酸濃度下，變異序列所占百分率的最低檢測(cè)限。

采用野生型臨床樣本和較高突變百分率的臨床樣本提取的核酸儲(chǔ)備液進(jìn)行混合，確定擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的核酸濃度，采用合理的試驗(yàn)方法（如深測(cè)序）對(duì)混合后樣本中變異序列所占百分率進(jìn)行確認(rèn)，并逐漸調(diào)整野生型和突變型核酸儲(chǔ)備液的比例以得到含不同突變序列百分率的混合液。如上述方法不易實(shí)現(xiàn)，也可采用含相應(yīng)變異類(lèi)型的質(zhì)粒與基因變異對(duì)應(yīng)的野生型基因組DNA混合的方法來(lái)制備相應(yīng)的混合液。對(duì)各份混合液進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，確定95%陽(yáng)性檢出率水平，作為在固定的核酸濃度條件下，可以檢測(cè)到的最低的突變序列百分率。

舉例：在50ng/40μL水平，可以達(dá)到95%陽(yáng)性檢出率的最低突變序列百分率為10%。

2.6.2在特定突變序列百分率下，反應(yīng)終體系中核酸濃度的最低檢測(cè)限。

采用合理的試驗(yàn)方法確定待測(cè)樣本中的突變序列所占的百分率，或采用突變型質(zhì)粒與野生型基因組DNA按一定比例混合（如固定在10%的水平），再逐級(jí)稀釋成不同核酸濃度樣本，對(duì)不同濃度樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，確定適當(dāng)檢出率水平（如：95%）下的最低DNA（RNA）濃度，即為核酸濃度的最低檢測(cè)限。系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%），可根據(jù)各濃度梯度檢測(cè)結(jié)果直接判定，也可通過(guò)概率計(jì)算或其他適當(dāng)方法進(jìn)行研究。

舉例：在10%的突變序列百分率水平，40μL擴(kuò)增反應(yīng)終體系中，DNA濃度的最低檢測(cè)限為50ng/40μL。

2.6.3系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%）。檢出限的聲稱(chēng)應(yīng)同時(shí)明確核酸濃度和突變比例。

2.6.4檢出限的驗(yàn)證

選取與建立不同的臨床樣本對(duì)聲稱(chēng)可檢測(cè)的變異位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，建議對(duì)檢出限附近濃度水平的樣本進(jìn)行至少20次的重復(fù)檢測(cè)，應(yīng)滿足95%檢出率要求。

2.7 分析特異性

2.7.1野生型驗(yàn)證：采用高低不同濃度的野生型核酸樣本進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)為陰性或野生型。

2.7.2交叉反應(yīng)，對(duì)于此類(lèi)產(chǎn)品的交叉反應(yīng)驗(yàn)證主要考慮以下幾方面情形：

2.7.2.1申報(bào)試劑所覆蓋的全部突變類(lèi)型間的交叉反應(yīng)；

2.7.2.2核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其他突變類(lèi)型序列間的交叉反應(yīng)。

2.7.2.3對(duì)于可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的病原體，需在有臨床意義相關(guān)濃度下進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)菌濃度水平建議至少106 cfu/mL，病毒濃度水平建議至少105 pfu/mL。需明確進(jìn)行交叉反應(yīng)的病原體類(lèi)型及滴度。

申請(qǐng)人應(yīng)提供生信分析結(jié)果以及所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的突變或野生型序列來(lái)源、序列確認(rèn)和濃度選擇等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

2.7.3干擾物質(zhì)

應(yīng)針對(duì)可能的內(nèi)源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。

2.7.3.1申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)試劑盒所采用的樣本類(lèi)型，確定潛在的干擾物質(zhì)。如對(duì)于外周血樣本，內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、人DNA、RNA等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑、樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)（如樣本采集管及保存管中活性成分等）、核酸提取/純化過(guò)程可能含有的干擾物質(zhì)、常用藥物及其代謝物等。對(duì)于病理組織，還需考慮病理組織處理過(guò)程及樣本穿刺過(guò)程的緩沖液、處理液、常用治療藥物等；非人源的核酸物質(zhì)等。

2.7.3.2用于干擾試驗(yàn)的樣本，靶基因濃度建議采用低突變率條件下包含低濃度在內(nèi)的至少兩個(gè)濃度水平，使用高濃度的干擾物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的特點(diǎn)及臨床用途，設(shè)置合理的結(jié)果接受標(biāo)準(zhǔn)，如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

2.8樣本核酸分離/純化

樣本核酸的分離/純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸分離/純化是決定后續(xù)核酸擴(kuò)增過(guò)程成敗的要素之一。尤其是石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過(guò)程中，會(huì)使樣品中的核酸與核酸之間，核酸與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，同時(shí)會(huì)引入C>T，G>A的假陽(yáng)性突變，并且樣本在不當(dāng)?shù)谋４鏃l件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸分離/純化的難度。除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物，以及降低福爾馬林固定過(guò)程引入的假陽(yáng)性。常見(jiàn)的核酸分離純化均有其優(yōu)勢(shì)和不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，無(wú)論申報(bào)產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)提交配套使用的核酸分離/純化方法的核酸提取性能研究資料，應(yīng)對(duì)核酸提取效率、提取核酸純度、濃度、片段完整性以及提取重復(fù)性等進(jìn)行充分的驗(yàn)證, 申請(qǐng)人需設(shè)置評(píng)價(jià)方案和評(píng)價(jià)指標(biāo)并評(píng)價(jià)選定的每種核酸提取純化方法能否滿足申報(bào)產(chǎn)品的要求，結(jié)合配套檢測(cè)試劑至少對(duì)各基因變異類(lèi)型的檢出限、重復(fù)性和干擾性進(jìn)行驗(yàn)證。申請(qǐng)人應(yīng)明確樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。不同樣本類(lèi)型應(yīng)分別進(jìn)行核酸提取/純化性能的研究驗(yàn)證。

2.9反應(yīng)體系

包括分析前樣本類(lèi)型的選擇、樣本采集、預(yù)處理（如有）、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)。并需明確樣本所需達(dá)到的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及確定過(guò)程。

2.9.1基因位點(diǎn)選擇、方法學(xué)特性介紹。

2.9.2提供確定最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括核酸提取用樣本體積、洗脫體積、反應(yīng)體系中的樣本用量、試劑用量、添加劑用量（如有）、反應(yīng)體系各成分終濃度(如酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度等)、反應(yīng)體積等。設(shè)置反應(yīng)體系需要的核酸含量上限和下限。如反應(yīng)體系中起始DNA濃度過(guò)高，可能導(dǎo)致反應(yīng)體系發(fā)生非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。如反應(yīng)體系中起始DNA濃度過(guò)低，可能導(dǎo)致反應(yīng)體系無(wú)靶序列擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

2.9.3提供確定逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的溫度和時(shí)間的研究資料（如涉及），PCR反應(yīng)體系及檢測(cè)過(guò)程中涉及的反應(yīng)條件/參數(shù)（如PCR反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)、熒光采集時(shí)間等）等的研究資料。

2.9.4提供質(zhì)控體系設(shè)置、Ct值或靶值確定的研究資料。

2.9.5提供不同機(jī)型基線、閾值循環(huán)數(shù)（Ct）、熒光強(qiáng)度（如適用）確定的研究資料。

2.9.6不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。

2.9.7如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。

3.穩(wěn)定性研究資料

主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、使用穩(wěn)定性（如開(kāi)瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性（如適用）、機(jī)載穩(wěn)定性（如適用）等）、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4.陽(yáng)性判斷值研究資料

對(duì)于此類(lèi)試劑，陽(yáng)性判斷值確定資料包含檢測(cè)基因變異的陽(yáng)性判斷值與對(duì)腫瘤治療藥物伴隨診斷用途的陽(yáng)性判斷值。

對(duì)于檢測(cè)基因變異的陽(yáng)性判斷值，主要是指Ct值的確認(rèn)資料，建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理的方式對(duì)申報(bào)產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。如果試劑存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說(shuō)明灰區(qū)范圍的確定方法。應(yīng)針對(duì)不同樣本類(lèi)型（如有）分別進(jìn)行陽(yáng)性判斷值研究，明確是否有差異。應(yīng)在獨(dú)立樣本人群中對(duì)經(jīng)研究擬確定的cut-off值進(jìn)行充分驗(yàn)證。申請(qǐng)人應(yīng)詳述試驗(yàn)方案、樣本來(lái)源、樣本量、樣本入組標(biāo)準(zhǔn)及試驗(yàn)結(jié)果等。

對(duì)于腫瘤治療藥物伴隨診斷用途的陽(yáng)性判斷值，在設(shè)定申報(bào)試劑檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性判斷值確定依據(jù)時(shí)，應(yīng)包括陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)研究方案、設(shè)定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、研究過(guò)程、研究原始數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析、結(jié)果與結(jié)論等。方案應(yīng)考慮不同影響檢測(cè)結(jié)果的因素，如人群流行病學(xué)信息、疾病類(lèi)型等。應(yīng)列舉陽(yáng)性判斷值計(jì)算過(guò)程中采用的所有統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。如存在不同樣本類(lèi)型，應(yīng)明確臨界值在不同樣本類(lèi)型中是否有差異并提供支持性研究資料。對(duì)于原研伴隨診斷試劑，結(jié)合藥物臨床試驗(yàn)進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的研究。對(duì)于非原研伴隨診斷試劑，如申報(bào)產(chǎn)品分析靈敏度顯著高于原研伴隨診斷試劑，則申報(bào)產(chǎn)品應(yīng)依據(jù)其伴隨診斷用途，參考原研伴隨診斷試劑陽(yáng)性判斷值確定合理的用于病例指導(dǎo)用藥的陽(yáng)性判斷值

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

此類(lèi)產(chǎn)品的主要反應(yīng)成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、陰陽(yáng)性質(zhì)控品（如包含）、檢測(cè)所需引物、探針、各種酶、dNTPs等。申請(qǐng)人應(yīng)提交核心反應(yīng)體系原材料的選擇過(guò)程，包括理論分析和試驗(yàn)驗(yàn)證。除核心反應(yīng)體系原材料之外的其他主要原材料，可免于提交選擇過(guò)程，直接提交選擇后的驗(yàn)證資料。具體要求可參考《體外診斷試劑主要原材料研究注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》。相關(guān)原材料的來(lái)源、選擇、制備方法的研究資料、質(zhì)量分析證書(shū)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和檢驗(yàn)資料等相關(guān)研究資料。主要原材料如為申請(qǐng)人自制，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定，并應(yīng)提交自制所需原料及自制過(guò)程及工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證報(bào)告；如為申請(qǐng)人外購(gòu)，還應(yīng)提交供應(yīng)商篩選資料、供應(yīng)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及申請(qǐng)人出具的該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。如適用，提交企業(yè)參考品的研究資料，包括來(lái)源、組成、陰陽(yáng)性和/或量值確認(rèn)等。

5.1.1核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTPs）

主要包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。如為外購(gòu)，應(yīng)提交對(duì)純度、濃度等的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及驗(yàn)證資料；如為自制，需提交自制所需原材料、自制過(guò)程、脫氧三磷酸核苷產(chǎn)物鑒定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（如分子量、濃度、純度等）制定與驗(yàn)證及功能性驗(yàn)證的資料。

5.1.3引物、探針

申請(qǐng)人應(yīng)詳述引物探針的設(shè)計(jì)原則、靶基因座位選擇、靶基因信息（基因名稱(chēng)、參考序列號(hào)），同時(shí)應(yīng)提供引物探針核酸序列、模板核酸序列及兩者對(duì)應(yīng)關(guān)系。結(jié)合基因突變位點(diǎn)檢測(cè)原理，明確各引物探針在檢測(cè)過(guò)程中所起的作用。建議設(shè)計(jì)多套引物探針以供篩選，針對(duì)待測(cè)位點(diǎn)的準(zhǔn)確性、特異性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇最佳設(shè)計(jì)，并提交詳細(xì)的篩選研究數(shù)據(jù)。

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)選定的引物探針原材料進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，一般包括：序列準(zhǔn)確度、分子量、純度（探針純度應(yīng)達(dá)到HPLC純）、濃度、探針熒光標(biāo)記物及其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)（如適用），以及功能性試驗(yàn)等，并依據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

如為外購(gòu)，還應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如合成引物探針序列、分子量、序列修飾基團(tuán)、PAGE結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜等。

5.1.4酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，部分酶具有核酸外切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性；尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對(duì)酶活性、特異性進(jìn)行合理驗(yàn)證。

5.1.5試劑盒內(nèi)對(duì)照品（質(zhì)控品）

試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種試劑盒對(duì)照品來(lái)實(shí)現(xiàn)，質(zhì)控體系需考慮對(duì)樣本核酸分離/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行合理的質(zhì)量控制。所有陽(yáng)性對(duì)照品的核酸性質(zhì)應(yīng)與待測(cè)樣本的靶核酸性質(zhì)一致，如同為DNA或RNA。對(duì)照品可采用質(zhì)粒、細(xì)胞系、假病毒或臨床樣本的核酸提取液等進(jìn)行配制。申請(qǐng)人應(yīng)提交試劑盒對(duì)照品有關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程、濃度范圍等試驗(yàn)資料，并對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果做出明確的范圍要求。申請(qǐng)人應(yīng)視申報(bào)產(chǎn)品具體情況設(shè)置合理的試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品），試劑盒質(zhì)控體系主要考慮以下幾方面要求。

5.1.5.1陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控品）

建議對(duì)每個(gè)樣品反應(yīng)管設(shè)置至少一份陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控品），不建議采用質(zhì)粒。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)各種陽(yáng)性對(duì)照品（質(zhì)控品）的Ct值做出明確的范圍要求。如樣本反應(yīng)管內(nèi)可以覆蓋多種突變序列的檢測(cè)（分型或不分型），相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)選擇較常見(jiàn)突變序列或理論上較難測(cè)得的突變序列作為陽(yáng)性對(duì)照。

5.1.5.2內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）

內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，尤其是靶核酸為RNA、用于基因重排或基因表達(dá)異常等檢測(cè)目的時(shí)，可以采用管家基因或與靶基因濃度水平相當(dāng)?shù)钠渌蛐蛄凶鳛橄鄳?yīng)的內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。

5.1.5.3陰性對(duì)照

陰性對(duì)照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可以是空白對(duì)照，以對(duì)可能存在的交叉污染進(jìn)行假陽(yáng)性結(jié)果的質(zhì)控。陰性對(duì)照品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。

由于臨床標(biāo)本多為經(jīng)過(guò)復(fù)雜處理的病理切片或組織，其中核酸的完整性容易被破壞，從而影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果，造成假陰性的可能性。因此，除上述對(duì)照品外，申報(bào)試劑的反應(yīng)體系中應(yīng)充分考慮對(duì)核酸分離/純化環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，比如，設(shè)置專(zhuān)門(mén)的質(zhì)控管或內(nèi)標(biāo)對(duì)管家基因或其他源于人類(lèi)基因組DNA的靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，以對(duì)核酸分離/純化的質(zhì)量及效率進(jìn)行評(píng)估。

5.1.6企業(yè)參考品：

應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明有關(guān)企業(yè)內(nèi)部參考品的原料選擇、制備過(guò)程、定值研究、評(píng)價(jià)指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等試驗(yàn)資料。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)部參考品的來(lái)源、基因序列設(shè)置等信息進(jìn)行精確的試驗(yàn)驗(yàn)證，并提供參考品溯源過(guò)程的測(cè)量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細(xì)的驗(yàn)證資料。如該類(lèi)產(chǎn)品有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，在不低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品要求前提下，申請(qǐng)人可以結(jié)合實(shí)際情況設(shè)置合理的企業(yè)參考品。代表性位點(diǎn)要求與分析性能中的代表性位點(diǎn)要求一致。

具體要求如下：

5.1.6.1陽(yáng)性參考品

試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點(diǎn)均應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的陽(yáng)性參考品，每個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)置不同突變百分率梯度，其中至少應(yīng)包括高濃度和低濃度陽(yáng)性參考品。陽(yáng)性參考品的突變形式及拷貝數(shù)/濃度需采用有效方法（如測(cè)序方法或數(shù)字PCR等）確認(rèn)，并明確接受標(biāo)準(zhǔn)。如為自建方法，需提交自建方法的性能確認(rèn)資料。

如申報(bào)試劑用于DNA樣本的檢測(cè)，則陽(yáng)性參考品可以采用臨床樣本或其提取的DNA儲(chǔ)備液、或細(xì)胞系（如有）作為原料。如申報(bào)試劑用于RNA樣本的檢測(cè)，陽(yáng)性參考品可以采用臨床樣本提取的RNA儲(chǔ)備液、相應(yīng)RNA凍干粉或假病毒的形式；如可以對(duì)其中部分罕見(jiàn)突變位點(diǎn)采用質(zhì)粒的形式，但不能全部采用質(zhì)粒，需包括部分突變類(lèi)型（申請(qǐng)人自行確定其代表性）RNA為模板的陽(yáng)性參考品以對(duì)逆轉(zhuǎn)錄（RT）過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控。

5.1.6.2陰性參考品

應(yīng)考慮檢測(cè)特異性的評(píng)價(jià)，納入同源序列交叉反應(yīng)樣本、干擾樣本等?？刹捎媒?jīng)確認(rèn)無(wú)相應(yīng)靶突變序列的野生型DNA儲(chǔ)備液。

5.1.6.3檢測(cè)限參考品

檢測(cè)限參考品的原料要求參考陽(yáng)性參考品，需包括所有申報(bào)的基因變異位點(diǎn)。對(duì)于以一段無(wú)突變熱點(diǎn)序列的所有突變作為檢測(cè)靶標(biāo)（如EGFR 19Del）的情形，則可選擇代表性變異進(jìn)行參考品設(shè)置。當(dāng)設(shè)置檢測(cè)限參考品時(shí)，可以?xún)H設(shè)置一個(gè)濃度水平，該水平可略高于95%的陽(yáng)性檢出率水平，而設(shè)置為100%檢出，應(yīng)明確參考品中靶核酸濃度水平和突變百分率。

5.1.6.4精密度參考品

精密度參考品原料要求參考陽(yáng)性參考品，需至少包括弱陽(yáng)性、中或強(qiáng)陽(yáng)性水平的精密度驗(yàn)證，中/強(qiáng)陽(yáng)性精密度參考品可不必包括所有突變類(lèi)型，可選擇代表性位點(diǎn)進(jìn)行精密度參考品的設(shè)置。以常見(jiàn)突變類(lèi)型或理論上較難測(cè)得的突變序列為主，但弱陽(yáng)性參考品需包括所有突變位點(diǎn)；如果產(chǎn)品包含多個(gè)反應(yīng)管，每個(gè)反應(yīng)管應(yīng)選擇代表性的突變類(lèi)型設(shè)置精密度參考品。如有必要，建議同時(shí)設(shè)置陰性參考品精密度驗(yàn)證。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標(biāo)記（如有）等工藝過(guò)程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過(guò)程應(yīng)對(duì)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說(shuō)明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

（四）臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)的開(kāi)展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫(xiě)等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求。

針對(duì)與抗腫瘤藥物同步研發(fā)的伴隨診斷試劑，申請(qǐng)人可按照《與抗腫瘤藥物同步研發(fā)的原研伴隨診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》開(kāi)展臨床試驗(yàn)，針對(duì)非原研伴隨診斷試劑申請(qǐng)人可按照《抗腫瘤藥物的非原研伴隨診斷試劑臨床試驗(yàn)注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

（五）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。腫瘤個(gè)體化治療相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑的說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下內(nèi)容。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1預(yù)期用途：本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)人xx（腫瘤名稱(chēng)）xxx（樣本類(lèi)型）樣本的xxxx（基因名稱(chēng)）突變基因，可以以列表形式列明具體突變位點(diǎn)。其中yy（具體突變位點(diǎn)或類(lèi)型）用于yyy（伴隨的藥物名稱(chēng)）藥物的伴隨診斷。腫瘤的類(lèi)別及適用樣本類(lèi)型應(yīng)結(jié)合實(shí)際的臨床研究完成情況進(jìn)行確認(rèn)。

1.2適用人群：伴隨診斷試劑適用人群應(yīng)與抗腫瘤藥物的適用人群相對(duì)應(yīng)，應(yīng)為臨床上需要進(jìn)行檢測(cè)以明確是否能夠使用某種抗腫瘤藥物的人群。目標(biāo)人群可能隨著個(gè)體化藥物和試劑發(fā)展研究而發(fā)生微調(diào)，建議申請(qǐng)人參照最新研究指南或?qū)＜夜沧R(shí)。

1.3明確說(shuō)明該試劑盒僅用于對(duì)特定腫瘤患者靶基因序列的檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個(gè)體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、治療反應(yīng)及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

1.4臨床背景的介紹，包括相關(guān)適用人群特征、腫瘤的組織類(lèi)型、適用的樣本類(lèi)型、待測(cè)靶基因序列的特征及選擇依據(jù)，靶基因及其表達(dá)蛋白在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起到的作用，相關(guān)藥物或其他治療技術(shù)及其作用機(jī)理、與待測(cè)突變位點(diǎn)可能存在的關(guān)系等。

2.【檢驗(yàn)原理】

2.1對(duì)試劑盒檢測(cè)能夠覆蓋的所有突變位點(diǎn)或突變類(lèi)型進(jìn)行詳細(xì)描述（靶序列長(zhǎng)度、基因座位、突變類(lèi)型及相關(guān)特征等），對(duì)引物及探針設(shè)計(jì)、不同樣品反應(yīng)管組合、對(duì)照品設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行逐項(xiàng)介紹。明確內(nèi)標(biāo)基因名稱(chēng)及其作用。

2.2核酸分離/純化方法、原理等。

2.3試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如添加了相關(guān)的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成分】

3.1詳細(xì)說(shuō)明試劑盒內(nèi)各組分的名稱(chēng)、數(shù)量、裝量各組分內(nèi)的成分等信息，說(shuō)明各組分中的核心反應(yīng)成分、生物活性材料、固相載體、顯色/發(fā)光物質(zhì)、基質(zhì)、防腐劑等信息，必要時(shí)，明確組分在基質(zhì)中的濃度、比例等信息。陰性/陽(yáng)性對(duì)照品（或質(zhì)控品）可能含有生物源性物質(zhì)的組分，應(yīng)說(shuō)明其生物學(xué)來(lái)源、活性及其他特性；說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。如試劑盒中包含耗材，應(yīng)列明耗材名稱(chēng)、數(shù)量等信息。

3.2試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組分，如核酸提取試劑、單獨(dú)注冊(cè)的校準(zhǔn)品/質(zhì)控品、樣本保存液等，注冊(cè)人應(yīng)列出相關(guān)試劑的產(chǎn)品名稱(chēng)、注冊(cè)人（備案人）、貨號(hào)及其注冊(cè)證編號(hào)（備案編號(hào)）及其他必要的信息。若有配合使用的單獨(dú)注冊(cè)的軟件，列明軟件名稱(chēng)、發(fā)布版本號(hào)、注冊(cè)人、注冊(cè)證號(hào)等信息。

3.3如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的注冊(cè)人（備案人）、產(chǎn)品名稱(chēng)以及該產(chǎn)品的貨號(hào)及其注冊(cè)證編號(hào)(備案編號(hào))等詳細(xì)信息。4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等。

4.【適用儀器】

所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

5.【樣本要求】 

重點(diǎn)明確以下內(nèi)容：

5.1對(duì)適用的樣本類(lèi)型作詳細(xì)介紹，包括樣本來(lái)源及取材要求、樣本處理方式（如組織樣本的固定及包埋方式）、腫瘤細(xì)胞比例等。

樣本的取材及處理方式等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。

5.2樣本處理及保存：核酸分離/純化前樣本的預(yù)處理、保存條件及期限、運(yùn)輸條件及期限（如適用）等。分離純化后的核酸如可不立即使用，則需明確其保存條件和保存期限，如冷凍保存，還需明確凍融次數(shù)。

5.3在核酸分離/純化過(guò)程結(jié)束后，應(yīng)采用適當(dāng)方法對(duì)分離/純化后的核酸儲(chǔ)備液進(jìn)行質(zhì)量控制。比如，采用分光光度計(jì)法對(duì)分離/純化后的核酸儲(chǔ)備液進(jìn)行濃度、純度檢測(cè)，并依據(jù)性能驗(yàn)證結(jié)果在此給出用于擴(kuò)增試驗(yàn)的核酸溶液濃度范圍要求。舉例：擴(kuò)增反應(yīng)終體系中需要50ng的脫氧核糖核酸（DNA）量，而在終體系中需加入25μL的DNA儲(chǔ)備液，則在DNA分離/純化完成后應(yīng)將DNA儲(chǔ)備液的濃度調(diào)整至2ng/μL的濃度。

如分離/純化后的核酸儲(chǔ)備液質(zhì)量（如濃度范圍）不符合要求，應(yīng)重新取材或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/純化。

5.4明確操作過(guò)程中各種制備液的穩(wěn)定性要求，如各類(lèi)混合液（Mix）、DNA/RNA儲(chǔ)備液、反應(yīng)終體系等的保存條件、儲(chǔ)存期限及凍融次數(shù)（如涉及）。

6.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說(shuō)明試驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

6.1試劑配制方法、注意事項(xiàng)。

6.2詳述核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)，明確核酸提取的樣本體積、核酸洗脫體積、明確提取核酸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照品（質(zhì)控品）應(yīng)參與樣本核酸的平行提取（如有必要），以對(duì)核酸分離/純化環(huán)節(jié)進(jìn)行合理的質(zhì)量控制。

6.3擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注意事項(xiàng)等。

6.4逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程（如涉及）的溫度和時(shí)間設(shè)置、PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。

6.5儀器設(shè)置：明確關(guān)鍵參數(shù)，待測(cè)基因、內(nèi)標(biāo)和對(duì)照品的熒光通道選擇等。

7.【陽(yáng)性判斷值】

包括基線的確定方法和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）的要求（如適用）。通過(guò)擴(kuò)增曲線和Ct值進(jìn)行陰陽(yáng)性的判斷。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果（Ct值）及擴(kuò)增曲線，對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)對(duì)灰區(qū)結(jié)果的處理方式一并詳述。

9.【檢驗(yàn)方法的局限性】

9.1本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者個(gè)體化治療的選擇應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

9.2陰性結(jié)果不能完全排除靶基因突變的存在，樣本中腫瘤細(xì)胞過(guò)少、核酸過(guò)度降解或擴(kuò)增反應(yīng)體系中靶基因濃度低于檢測(cè)限亦可造成陰性結(jié)果。

9.3腫瘤組織（細(xì)胞）可能存在較大異質(zhì)性，不同部位取樣可能會(huì)得到不同的檢測(cè)結(jié)果。

9.4不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理，以及不當(dāng)?shù)脑囼?yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。

9.5明確該檢測(cè)僅限于規(guī)定的樣本類(lèi)型及檢測(cè)系統(tǒng)（包括適用機(jī)型、核酸分離/純化試劑、檢測(cè)方法等）。

9.6 FFPE樣本在固定過(guò)程中可能引入新的突變，影響檢測(cè)性能。建議進(jìn)行評(píng)估和通過(guò)相應(yīng)的方案降低假陽(yáng)性。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

根據(jù)研究資料詳述以下性能指標(biāo)：

10.1對(duì)相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（如有）和企業(yè)參考品檢測(cè)的符合情況。

10.2最低檢測(cè)限：說(shuō)明在試劑盒規(guī)定的檢測(cè)條件及擴(kuò)增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類(lèi)別的最低檢出濃度，重點(diǎn)考慮原始模板中突變基因的百分率和擴(kuò)增終體系中核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)最低檢測(cè)限的影響；并簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的確定方法。

10.3精密度：簡(jiǎn)要介紹不同機(jī)型、不同樣本類(lèi)型的精密度評(píng)價(jià)方法和結(jié)果。(包括重復(fù)性、中間精密度和再現(xiàn)性評(píng)價(jià)結(jié)果)

10.4分析特異性

對(duì)分析性能評(píng)估中特異性研究?jī)?nèi)容進(jìn)行歸納。

10.4.1野生型驗(yàn)證：應(yīng)采用不同濃度的野生型核酸樣本進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果應(yīng)均為陰性,至少包括檢測(cè)上限和檢測(cè)下限濃度。

10.4.2試劑盒內(nèi)交叉反應(yīng)：如考核試劑包括對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，則應(yīng)對(duì)該試劑盒覆蓋范圍內(nèi)的所有突變類(lèi)型間進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證。

10.4.3序列相近或具有一定同源性的其他較常見(jiàn)突變或野生型基因序列間的交叉反應(yīng)驗(yàn)證。

10.4.4潛在干擾物質(zhì)驗(yàn)證。

如果經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，則應(yīng)該對(duì)存在交叉反應(yīng)的核酸序列及濃度進(jìn)行驗(yàn)證并在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中表明這種假陽(yáng)性發(fā)生的可能，做出相關(guān)的提示。

10.5臨床試驗(yàn)：簡(jiǎn)要介紹試驗(yàn)方法、對(duì)比試劑（方法）信息、受試者及樣本、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果和結(jié)論等。

11.【注意事項(xiàng)】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

 

三、參考文獻(xiàn)

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