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摘要

抗體偶聯(lián)藥物(antibody-drug conjugate, ADC)是將小分子藥物(payload)通過(guò)化學(xué)連接子(linker)偶聯(lián)到單克隆抗體上形成的靶向藥物。近年來(lái), ADC研發(fā)蓬勃發(fā)展, 全球已有10余款A(yù)DC獲批上市。隨著技術(shù)進(jìn)步, 新一代ADC呈現(xiàn)出更加復(fù)雜的設(shè)計(jì)趨勢(shì), 如在同一抗體分子上偶聯(lián)2種不同的載荷(即雙載荷ADC)。雙載荷ADC有望通過(guò)一次給藥同時(shí)遞送2種有效載荷, 增強(qiáng)對(duì)異質(zhì)性腫瘤的殺傷并克服耐藥。然而, 這類ADC因結(jié)構(gòu)復(fù)雜、均一性/雜質(zhì)控制難度高, 給藥學(xué)研究與監(jiān)管審評(píng)帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。本文探討雙載荷ADC研發(fā)進(jìn)展和藥學(xué)審評(píng)關(guān)注點(diǎn), 包括生產(chǎn)用原材料、生產(chǎn)工藝、結(jié)構(gòu)表征與雜質(zhì)研究、分析方法、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性研究等方面, 結(jié)合實(shí)際申報(bào)中發(fā)現(xiàn)的藥學(xué)研究缺陷, 探討雙載荷ADC產(chǎn)品的研發(fā)進(jìn)展和藥學(xué)審評(píng)考慮, 旨在為該類產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和藥學(xué)研究提供實(shí)用參考。

關(guān)鍵詞

雙載荷抗體偶聯(lián)藥物; 結(jié)構(gòu)異質(zhì)性; 藥學(xué)研究

抗體偶聯(lián)藥物(antibody-drug conjugate, ADC)是將單克隆抗體的高度靶向性與小分子細(xì)胞毒素的強(qiáng)效殺傷作用相結(jié)合, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的定向消除。自2000年首款A(yù)DC藥物獲批以來(lái), 隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和累積, 從2020年開(kāi)始ADC領(lǐng)域呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)趨勢(shì), 新一代ADC在連接子穩(wěn)定性、藥效和安全性上均有顯著改進(jìn)。目前全球已有超過(guò)15款A(yù)DC上市, 用于乳腺癌、淋巴瘤等多種腫瘤的治療。在我國(guó), ADC研發(fā)亦方興未艾, 已有多款本土研發(fā)的ADC獲得上市許可, 進(jìn)入臨床研究階段的ADC數(shù)量也呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)。從分子結(jié)構(gòu)上看, 除傳統(tǒng)的單一載荷ADC外, 還包括在同一抗體分子上偶聯(lián)2種不同的載荷(即雙載荷ADC)。相較于單一載荷ADC, 雙載荷ADC在藥效方面存在一定潛在優(yōu)勢(shì), 例如: 研究顯示將2種不同作用機(jī)制的細(xì)胞毒性藥物結(jié)合于同一ADC, 可同時(shí)作用于腫瘤細(xì)胞, 從而克服單一藥物可能引發(fā)的耐藥并提高療效。還有研究嘗試在ADC上同時(shí)偶聯(lián)細(xì)胞毒性藥物和免疫激活劑, 實(shí)現(xiàn)“化療+免疫”雙重打擊, 這類“雙彈頭”ADC有望在對(duì)抗腫瘤耐藥和異質(zhì)性方面通過(guò)其特有的多種小分子間協(xié)同或正交作用發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。此外, 對(duì)于同樣含有2種以上小分子的其他治療策略, 如聯(lián)合化療、單一載荷ADC聯(lián)合化療、2種單一載荷ADC聯(lián)合等, 其將在相對(duì)一致的時(shí)間和空間上發(fā)揮各自功能, 腫瘤細(xì)胞攝入2種載荷的比例相對(duì)可控, 以上特點(diǎn)可能對(duì)藥物的臨床安全性、有效性產(chǎn)生積極影響。但與此同時(shí), 雙載荷ADC復(fù)雜的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性也對(duì)藥物的上游構(gòu)建、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量表征與控制等研究提出了更高要求。

目前, 全球雙載荷ADC研發(fā)仍處于起步階段, 尚無(wú)上市產(chǎn)品, 但若干候選藥物已進(jìn)入臨床研究。截至2025年5月, 我國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)已批準(zhǔn)2款雙載荷ADC的新藥臨床試驗(yàn)申請(qǐng)(investigational new drug, IND), 這也是全球最早獲準(zhǔn)開(kāi)展人體臨床試驗(yàn)的2款藥物。為更好地指導(dǎo)研發(fā), 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心于2024年發(fā)布了《抗體偶聯(lián)藥物藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》(以下簡(jiǎn)稱“指導(dǎo)原則”), 對(duì)ADC的藥學(xué)研究提出了相關(guān)要求, 其中對(duì)雙載荷ADC的偶聯(lián)工藝、過(guò)程控制、載藥分布和電荷異構(gòu)性表征等方面進(jìn)行了明確。由于雙載荷ADC的藥學(xué)開(kāi)發(fā)及相關(guān)研究與單載荷ADC有部分重疊, 本文僅對(duì)雙載荷ADC特有的藥學(xué)研究考慮進(jìn)行詳細(xì)討論, 包括生產(chǎn)用原材料、結(jié)構(gòu)表征、分析方法、雜質(zhì)研究、穩(wěn)定性研究、關(guān)鍵質(zhì)量屬性控制等, 相同部分不再贅述, 以期為該類藥物的研發(fā)提供幫助。

1 生產(chǎn)用原材料(裸抗及小分子)

2種載荷的選擇是雙載荷ADC作用機(jī)制的重要基礎(chǔ)和設(shè)計(jì)重點(diǎn)。目前, ADC產(chǎn)品主要應(yīng)用的載荷種類見(jiàn)表1。

雙載荷ADC的載荷選擇可采用正交策略(如遞送2種不同機(jī)制的載荷)或協(xié)同策略(如A藥物可增強(qiáng)B藥物的抗腫瘤活性)。對(duì)于正交策略, 載藥組合設(shè)計(jì)為RNA聚合酶抑制劑+拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑, 在DNA/RNA水平以2種互補(bǔ)的腫瘤殺傷機(jī)制克服腫瘤內(nèi)細(xì)胞的異質(zhì)性和耐藥性。此外, 也可選擇微管蛋白抑制劑+TLR激動(dòng)劑, 形成“化療+免疫”一體化的靶向藥物, 迅速減少腫瘤負(fù)荷, 并重編程腫瘤微環(huán)境, 招募和激活免疫細(xì)胞攻擊殘余腫瘤細(xì)胞。對(duì)于協(xié)同策略, 載藥組合一般設(shè)計(jì)為在同一作用通路上的2種載荷, 包括拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑+DNA損傷應(yīng)答抑制劑(如PARP抑制劑), 2種載荷均靶向腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制, 在同一通路的不同節(jié)點(diǎn)發(fā)揮作用, 有助于增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的敏感性。

連接子方面, 除分枝連接子外, 其他與單載荷ADC基本一致, 可分為可裂解連接子和不可裂解連接子。雙載荷ADC的2種載荷可能在不同的細(xì)胞定位(細(xì)胞內(nèi)/微環(huán)境)或不同釋放條件下發(fā)揮作用, 但卻依賴于同一個(gè)抗體分子所帶來(lái)的“制導(dǎo)作用”, 因此建議研發(fā)者從整體分子的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制綜合考慮, 評(píng)估不同載荷對(duì)應(yīng)連接子的設(shè)計(jì)對(duì)ADC分子的疏水性、空間結(jié)構(gòu)、載荷釋放時(shí)間及空間等屬性的影響, 確保雙載荷ADC發(fā)揮預(yù)期的作用機(jī)制。

裸抗方面, 由于雙載荷ADC生產(chǎn)中一般需要進(jìn)行2種正交的偶聯(lián)方式, 因此對(duì)裸抗進(jìn)行工程化改造引入額外的偶聯(lián)位點(diǎn)在該類產(chǎn)品中較為常見(jiàn)。涉及裸抗改構(gòu)的偶聯(lián)方式主要包括: 工程化半胱氨酸偶聯(lián)、非天然氨基酸偶聯(lián)、酶介導(dǎo)偶聯(lián)等。建議研發(fā)者在申報(bào)資料中詳細(xì)提供裸抗的改構(gòu)信息, 并在適當(dāng)節(jié)點(diǎn)對(duì)改構(gòu)結(jié)果進(jìn)行表征。例如: 涉及引入或替換氨基酸的, 建議在載體構(gòu)建、細(xì)胞庫(kù)表征、代表性裸抗批次的結(jié)構(gòu)確證等節(jié)點(diǎn), 采用測(cè)序、肽圖等方法在核苷酸/氨基酸水平上對(duì)改構(gòu)進(jìn)行確證性研究。此外, 對(duì)于僅在一條輕/重鏈上引入氨基酸突變用于偶聯(lián)的產(chǎn)品(如對(duì)于該載荷中ADC單分子的半邊載藥另外半邊不載藥), 盡管未突變鏈在后續(xù)工藝中不會(huì)偶聯(lián)對(duì)應(yīng)載荷, 而是在載藥分布表征中歸為該載荷的DAR0雜質(zhì), 但考慮到載藥分布表征前可能對(duì)樣品進(jìn)行還原等預(yù)處理, 因此難以代表正常條件下ADC的完整結(jié)構(gòu), 仍不能表征二硫鍵錯(cuò)配雜質(zhì)的含量(即使該類設(shè)計(jì)一般采用knob-into-hole結(jié)構(gòu))。審評(píng)建議在裸抗放行階段對(duì)二硫鍵錯(cuò)配雜質(zhì)進(jìn)行控制, 將有助于增強(qiáng)下游ADC產(chǎn)物的均質(zhì)性; 涉及糖基化修飾改構(gòu)的, 如酶介導(dǎo)的糖鏈修剪、疊氮化反應(yīng)添加偶聯(lián)基團(tuán)等, 建議在改構(gòu)操作前后設(shè)置過(guò)程控制節(jié)點(diǎn), 對(duì)中間產(chǎn)品的N寡糖譜進(jìn)行監(jiān)測(cè), 關(guān)注改構(gòu)操作的穩(wěn)健性和待偶聯(lián)樣品的批間一致性。

2 生產(chǎn)工藝

雙載荷ADC產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的主要特點(diǎn)為一般涉及2種偶聯(lián)方式。目前, 雙載荷ADC的偶聯(lián)策略主要分為以下2類: 基于小分子的分支連接子策略和基于氨基酸的正交偶聯(lián)策略?；谛》肿拥姆种нB接子策略采用具有多個(gè)分支的連接子, 將多個(gè)藥物分子通過(guò)相同偶聯(lián)位點(diǎn)連接到抗體上, 從而提高載藥率(drug-antibody ratio, DAR)。該方法又可細(xì)分為2類。①三臂或多臂連接子的其中一條主鏈與抗體結(jié)合, 其他分支通過(guò)多步偶聯(lián)工藝進(jìn)行多種載荷載藥。例如: SEACEN公司設(shè)計(jì)了一種含有2種不同保護(hù)基團(tuán)的半胱氨酸偶聯(lián)位點(diǎn)的分支連接子, 其分別在三(2-羧乙基)膦[tris(2-carboxyethyl) phosphine, TCEP]或乙酸汞處理下進(jìn)行脫保護(hù), 在抗體的鏈間二硫鍵中對(duì)分支連接子進(jìn)行常規(guī)的半胱氨酸偶聯(lián)后, 再進(jìn)行兩步脫保護(hù)-偶聯(lián)反應(yīng)以分別偶聯(lián)2種不同的載荷, 最終形成DAR值為16(8+8)的雙載荷ADC; ②分支載藥單元, 即在連接子合成階段直接負(fù)載多種小分子藥物。例如: 瑞士Araris Biotech AC公司通過(guò)微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(microbial trans-glutaminase, mTC)將雙載荷-連接子一步偶聯(lián)至抗體Fc段的Q295位點(diǎn), 最終獲得DAR值為4(2+2)的雙載荷ADC。該策略可實(shí)現(xiàn)單步雙載荷偶聯(lián), 提高生產(chǎn)效率, 然而使用此策略的挑戰(zhàn)在于每個(gè)載荷組合的分支連接子都需要重新設(shè)計(jì)合成, 因此開(kāi)發(fā)成本較高且靈活性受限。綜上所述, 分支連接子策略本質(zhì)上是雙載荷同偶聯(lián)位點(diǎn)(對(duì)抗體分子而言, 兩載荷預(yù)期偶聯(lián)至相同位點(diǎn))技術(shù), 其主要對(duì)小分子部分進(jìn)行設(shè)計(jì)和改構(gòu), 需要注意分枝結(jié)構(gòu)往往增大ADC的疏水性, 必要時(shí)可以考慮在連接子中引入疏水屏蔽基團(tuán)或親水鏈(如PEC)平衡整體水溶性, 以規(guī)避潛在的分子聚集和非特異性吸附等質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。

基于氨基酸的正交偶聯(lián)策略通過(guò)2種正交的偶聯(lián)方法, 即在抗體分子的不同位點(diǎn)分別偶聯(lián)2種載荷。目前, 主流的基于氨基酸的偶聯(lián)方法如下: 鏈間半胱氨酸偶聯(lián)、工程化半胱氨酸偶聯(lián)、工程化非天然氨基酸偶聯(lián)、酶催化偶聯(lián)(如微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶介導(dǎo)的Q295位點(diǎn)定點(diǎn)偶聯(lián)、半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化疊氮化反應(yīng)介導(dǎo)的糖鏈偶聯(lián))等。除鏈間/工程化半胱氨酸偶聯(lián)在偶聯(lián)機(jī)制上基本一致(但仍可通過(guò)關(guān)鍵工藝參數(shù)優(yōu)化完成雙載荷分步偶聯(lián))外, 以上主要使用的偶聯(lián)方法均具有一定特異性, 方法間相互影響較小, 為分步偶聯(lián)不同載荷提供了理論基礎(chǔ)。

工藝開(kāi)發(fā)方面, 雙載荷ADC復(fù)雜的生產(chǎn)工藝需要進(jìn)行更加深入和細(xì)致的工藝開(kāi)發(fā)研究。工藝開(kāi)發(fā)須綜合優(yōu)化2種偶聯(lián)反應(yīng)的條件, 確保均能達(dá)到目標(biāo)偶聯(lián)率, 對(duì)工藝參數(shù)研究提出了更深入的要求, 如不同還原度對(duì)每種載荷偶聯(lián)的影響、2種載荷偶聯(lián)先后順序的考量等。此外, 由于2種偶聯(lián)反應(yīng)一般是正交的, 在工藝放大過(guò)程中2種偶聯(lián)工藝的效率、雜質(zhì)殘留等可能呈現(xiàn)出非線性、不完全協(xié)調(diào)的變化趨勢(shì), 這意味著工藝放大研究不僅需要考慮偶聯(lián)工藝內(nèi)的工藝性能波動(dòng), 還應(yīng)綜合考慮偶聯(lián)工藝間的放大協(xié)調(diào)性。建議研發(fā)者基于“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的理念, 綜合考慮2種載荷的載藥分布、偶聯(lián)及偶聯(lián)前處理對(duì)產(chǎn)品整體分子的影響、偶聯(lián)產(chǎn)生的產(chǎn)品/工藝相關(guān)雜質(zhì)及所需清除能力、不同偶聯(lián)方式間的相互影響等因素, 合理選擇偶聯(lián)方式、偶聯(lián)順序和后續(xù)純化步驟, 開(kāi)展工藝開(kāi)發(fā)研究。

3 質(zhì)量研究和控制

3.1 特性鑒定

3.1.1 DAR值和載藥分布

雙載荷ADC存在多種載藥組合(a+b)形式, 其整體物質(zhì)組成中不僅包括總DAR值不同的ADC分子, 即使在總DAR值相同的分子中還包括2種載荷不同比例的載藥組合, 應(yīng)對(duì)不同載荷的偶聯(lián)特性進(jìn)行分別表征與控制。單載荷ADC的產(chǎn)品經(jīng)驗(yàn)顯示, 載藥數(shù)量及分布是影響產(chǎn)品安全性和有效性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性, 進(jìn)而可以預(yù)期雙載荷ADC中任一載荷平均載藥數(shù)量或不同載藥組合比例的波動(dòng)都可能直接影響產(chǎn)品的療效和安全性。因此, 基于偶聯(lián)方式、偶聯(lián)位點(diǎn)、載荷間理化性質(zhì)差異等因素, 選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒▽?duì)DAR值和載藥分布進(jìn)行研究, 對(duì)于評(píng)估雙載荷ADC產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)均一性、批間質(zhì)量一致性具有重要意義。

對(duì)于雙載荷ADC的載藥特性表征, 適當(dāng)?shù)姆治龇椒☉?yīng)充分利用2種載荷間的理化性質(zhì)差異以區(qū)分不同載荷的載藥情況。目前, 應(yīng)用于單載荷ADC的DAR值檢測(cè)分析方法主要有疏水作用色譜(hydrophobic interaction chromatography-high performance liquid chromatography, HIC-HPLC)、反相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)、紫外-可見(jiàn)分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV/Vis)和毛細(xì)管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate, CE-SDS)等。其中, UV/Vis法和CE-SDS法的檢測(cè)原理分別為通過(guò)檢測(cè)小分子的吸光度和相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)載荷的載藥情況進(jìn)行半定量分析。但對(duì)于同時(shí)檢測(cè)2種載荷, 載荷間的吸收光譜和相對(duì)分子質(zhì)量差異可能不足以在分析方法的靈敏度內(nèi)有效區(qū)分2種載荷, 即方法的專屬性不能支持分別報(bào)告2種載荷的載藥量, 目前申報(bào)的雙載荷ADC產(chǎn)品中也未見(jiàn)以此2種分析方法表征DAR值。HIC-HPLC法和RP-HPLC法均為基于疏水性差異以分離不同載藥量ADC分子的分析方法, 但由于2種方法在填料疏水性、樣品處理?xiàng)l件等方面的差異, 對(duì)于載藥特性的表征各有側(cè)重。HIC-HPLC法在非變性條件下進(jìn)行檢測(cè), 可在基本保留產(chǎn)品完整結(jié)構(gòu)的情況下分析其載藥特征, 其局限在于分離分辨率相對(duì)較低, 疏水性差異小的峰容易重疊, 在雙載荷ADC的分析中更容易被放大, 載荷間固有的疏水性差異疊加復(fù)雜的載藥數(shù)量組合是否足以在該方法中表現(xiàn)出足夠的峰分離度, 可能需要檢測(cè)參數(shù)的持續(xù)優(yōu)化并要求具體案例具體分析。RP-HPLC法是目前雙載荷ADC產(chǎn)品申報(bào)中較為常見(jiàn)的載藥特性分析方法, 該方法可將復(fù)雜的載藥組合通過(guò)還原處理在單鏈水平上進(jìn)行載藥分析, 其含有三氟乙酸的流動(dòng)相, 可以增強(qiáng)峰分離度。需要注意的是, 該方法中較強(qiáng)的還原條件可能造成載荷脫落, 導(dǎo)致DAR值略低于真實(shí)值。在雙載荷ADC中還應(yīng)考慮2種連接子-載荷對(duì)還原條件的敏感性是否一致, 盡可能優(yōu)化處理?xiàng)l件以準(zhǔn)確反映樣品載藥情況。雖然有報(bào)道表明優(yōu)化后的RP-HPLC方法可在無(wú)須樣品預(yù)處理(還原)的情況下進(jìn)行載藥分布檢測(cè), 但方法尚不成熟且暫未見(jiàn)業(yè)界應(yīng)用, 常規(guī)RP-HPLC方法的主要局限仍為無(wú)法直接在整體ADC分子水平上對(duì)載藥分布進(jìn)行表征, 需要其他方法進(jìn)行互補(bǔ)分析。LC-MS法為基于相對(duì)分子質(zhì)量的分析方法, 對(duì)ADC分子進(jìn)行Lys-C等酶降解后, 通過(guò)分析肽段的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)碎片離子信息, 對(duì)偶聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行確證, 并根據(jù)偶聯(lián)/未偶聯(lián)肽段的色譜峰面積比例計(jì)算單個(gè)偶聯(lián)位點(diǎn)占有率。該方法的精度和靈敏度較高, 其肽段水平的分析一般情況下可以在一定程度上規(guī)避2種載荷在整體分析中難以有效區(qū)分的問(wèn)題, 同時(shí)可以通過(guò)有無(wú)異常峰型相對(duì)準(zhǔn)確地判斷非預(yù)期偶聯(lián)(如單載荷非預(yù)期位點(diǎn)偶聯(lián)、雙載荷交叉偶聯(lián)等)的發(fā)生。同樣, 高精度伴隨對(duì)整體結(jié)構(gòu)反映的不足, 在實(shí)際應(yīng)用中, 可以考慮與RP-HPLC聯(lián)用, 基于相對(duì)分子質(zhì)量和疏水性對(duì)雙載荷ADC產(chǎn)品的載藥情況進(jìn)行正交表征。此外, 如指導(dǎo)原則所述, 可采用酶解、還原等方式分段降低ADC分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性, 該策略在雙載荷ADC產(chǎn)品中應(yīng)用頻次更高, 建議申請(qǐng)人根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)選擇合理的預(yù)處理方式以完善載藥特性表征。

3.1.2 生物學(xué)活性

目前, ADC產(chǎn)品的基于作用機(jī)制的細(xì)胞水平生物學(xué)活性檢測(cè)一般采用ADC與表面表達(dá)靶抗原的靶細(xì)胞共孵育的體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)。雙載荷ADC的生物學(xué)活性分析方法及控制策略與單載荷ADC基本一致, 但建議關(guān)注并表征其相較于單載荷ADC的額外作用機(jī)制: 是否在特定模型中表現(xiàn)出協(xié)同增效或擴(kuò)大的細(xì)胞殺傷能力。例如, 可分別制備僅偶聯(lián)藥物a或僅偶聯(lián)藥物b的ADC, 與雙載荷ADC平行進(jìn)行細(xì)胞毒性比較。如果雙載荷設(shè)計(jì)具有協(xié)同作用, 應(yīng)當(dāng)體現(xiàn)在雙載荷ADC對(duì)某些細(xì)胞的殺傷強(qiáng)于任一單載荷ADC; 如果雙載荷設(shè)計(jì)具有正交作用, 則能夠殺傷單載荷ADC無(wú)效的耐藥靶細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)時(shí)也可考察不同靶抗原表達(dá)水平或不同耐藥狀態(tài)的細(xì)胞株對(duì)雙載荷ADC是否表現(xiàn)出差異化的敏感性, 以驗(yàn)證其克服耐藥及增強(qiáng)抗腫瘤活性的預(yù)期機(jī)制與潛在優(yōu)勢(shì)。對(duì)于載有免疫激動(dòng)劑的雙載荷ADC, 除表征其細(xì)胞毒性作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞的活性外, 應(yīng)同時(shí)開(kāi)發(fā)針對(duì)產(chǎn)品免疫激動(dòng)功能的體外分析方法, 例如: 根據(jù)激動(dòng)劑種類(TLR/STINC激動(dòng)劑), 構(gòu)建對(duì)應(yīng)分子通路的細(xì)胞水平熒光報(bào)告基因系統(tǒng)。

3.2 雜質(zhì)研究

交叉載藥雜質(zhì): 在雙載荷ADC的偶聯(lián)反應(yīng)中, 可能形成一些非預(yù)期的交叉雜質(zhì)。此類雜質(zhì)包括交叉偶聯(lián)產(chǎn)物(本應(yīng)連接藥物a的位點(diǎn)誤偶聯(lián)了藥物b或反之導(dǎo)致特定位點(diǎn)的雜合偶聯(lián))、載荷交聯(lián)物(例如: 在分支連接子策略中, 2種藥物未能分別連接在不同分支上, 而是發(fā)生了載荷間交聯(lián)或自偶聯(lián)副反應(yīng))等。交叉載藥雜質(zhì)的產(chǎn)生往往與偶聯(lián)工藝間的原理有部分交叉或與偶聯(lián)副反應(yīng)有關(guān), 如果2種載荷的偶聯(lián)機(jī)制不完全正交, 則可能發(fā)生彼此競(jìng)爭(zhēng)同一位點(diǎn)或互相反應(yīng)的情況。這些雜質(zhì)通常在結(jié)構(gòu)上與預(yù)期載藥形式高度相似, 但功能活性可能不同, 建議通過(guò)高靈敏度的分析方法(質(zhì)譜、肽圖等)加以鑒別和量化, 并通過(guò)工藝優(yōu)化將其含量控制在可接受范圍內(nèi)。

偶聯(lián)不完全或未偶聯(lián)雜質(zhì): 在雙載荷ADC制備過(guò)程中, 可能出現(xiàn)部分抗體分子未偶聯(lián)上2種載荷或其中之一的情況, 導(dǎo)致在最終產(chǎn)品中存在未偶聯(lián)的裸抗體(DAR=0)或只偶聯(lián)了1種藥物的“單載荷ADC”雜質(zhì)。例如: 采用不同位點(diǎn)分別偶聯(lián)載荷a和b的策略中, 如果某批次反應(yīng)中藥物b偶聯(lián)效率波動(dòng)至較低水平, 則會(huì)殘留某些僅帶有藥物a的ADC分子。該類不對(duì)稱未偶聯(lián)雜質(zhì)不能發(fā)揮預(yù)期的雙載荷間的協(xié)同或正交活性作用, 因此, 將對(duì)整體樣品的有效性造成稀釋作用, 同時(shí)由于其偶聯(lián)載荷數(shù)量少、疏水性較低, 可能表現(xiàn)出與主要載藥形式不同的藥動(dòng)學(xué)特征。建議在載藥特性的表征中對(duì)該類雜質(zhì)予以關(guān)注, 結(jié)合工藝穩(wěn)健性并基于風(fēng)險(xiǎn)合理擬定該類雜質(zhì)的控制策略, 如分別報(bào)告2種載荷的DAR0含量。

除上述雜質(zhì)外, 雙載荷ADC還面臨與單載荷ADC相似的雜質(zhì)和變異體問(wèn)題。例如: 由于高疏水性載藥導(dǎo)致的聚集體增加, 偶聯(lián)過(guò)程可能引入小分子副產(chǎn)物、偶聯(lián)方法特異性雜質(zhì)(如糖偶聯(lián)工藝中可能引入的糖鏈修剪、酶轉(zhuǎn)移鏈接、點(diǎn)擊反應(yīng)等步驟反應(yīng)不完全所產(chǎn)生的雜質(zhì))、電荷異構(gòu)體變化等。另外, 工藝相關(guān)雜質(zhì)的種類或殘留水平也可能因多種偶聯(lián)方法而增加, 建議研發(fā)者規(guī)范開(kāi)展各類工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留的安全因子范圍分析, 如涉及暫無(wú)毒理學(xué)數(shù)據(jù)的雜質(zhì)(自制酶等), 應(yīng)根據(jù)非臨床批次殘留量并結(jié)合分析方法和工藝的變異度綜合擬定其控制限度并納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?？傮w而言, 雙載荷ADC雜質(zhì)的復(fù)雜性主要來(lái)源于該類產(chǎn)品生產(chǎn)中多種偶聯(lián)方法的使用以及兩載荷間復(fù)雜的載藥分布組合。建議根據(jù)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)和所用偶聯(lián)工藝的特點(diǎn), 結(jié)合高靈敏度且正交的分析方法, 充分評(píng)估并表征雙載荷ADC的雜質(zhì), 為有效制定質(zhì)量控制策略提供基礎(chǔ)。

3.3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

檢驗(yàn)項(xiàng)目方面, 除ADC常規(guī)檢項(xiàng)外, 建議將與2種載荷有關(guān)的質(zhì)量屬性分別納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行控制。例如: DAR值(DAR-a和DAR-b)、載藥分布(各a+b構(gòu)型比例)、未偶聯(lián)抗體(未偶聯(lián)載荷a/b含量)、游離小分子含量(載荷a/b及有關(guān)物質(zhì)含量)等。此外, 應(yīng)根據(jù)雜質(zhì)研究結(jié)果, 評(píng)估非預(yù)期偶聯(lián)雜質(zhì)、偶聯(lián)工藝特異性雜質(zhì)等對(duì)產(chǎn)品臨床安全性和有效性的影響, 必要時(shí)納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)限度的擬定策略和依據(jù)與單載荷ADC基本一致。

4 穩(wěn)定性研究

相較于單載荷ADC(只需要監(jiān)控1種藥物的脫落), 雙載荷ADC需要同時(shí)關(guān)注2種不同藥物的潛在脫落。2種載荷的連接子可能對(duì)儲(chǔ)存條件(如溫度、光照強(qiáng)度、pH等)的敏感性不同, 進(jìn)而在穩(wěn)定性研究中出現(xiàn)選擇性脫落其中1種載荷的趨勢(shì), 從而逐漸改變產(chǎn)品內(nèi)載藥組合比例, 同時(shí)釋放游離的小分子藥物。因此, 在雙載荷ADC產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和臨床試驗(yàn)過(guò)程中, 應(yīng)在穩(wěn)定性研究中對(duì)2種載荷的脫落情況分別進(jìn)行監(jiān)測(cè), 根據(jù)游離小分子的波動(dòng)趨勢(shì), 合理優(yōu)化產(chǎn)品處方和儲(chǔ)存條件, 確保效期內(nèi)整體載藥分布和游離小分子水平的波動(dòng)處于可接受范圍內(nèi)。

5 總結(jié)與展望

隨著載荷/連接子種類的不斷豐富和偶聯(lián)技術(shù)的持續(xù)發(fā)展, 雙載荷ADC作為一種新興的分子設(shè)計(jì)策略, 展現(xiàn)出多靶點(diǎn)聯(lián)合打擊、協(xié)同增強(qiáng)療效及克服腫瘤異質(zhì)性和耐藥性的潛在優(yōu)勢(shì), 已成為下一代ADC產(chǎn)品的重要發(fā)展方向。然而, 這一設(shè)計(jì)所帶來(lái)的結(jié)構(gòu)/工藝復(fù)雜性也對(duì)藥物的研發(fā)和技術(shù)審評(píng)提出了挑戰(zhàn)。本文結(jié)合目前雙載荷ADC的研發(fā)進(jìn)展, 對(duì)該類產(chǎn)品的生產(chǎn)用原材料、生產(chǎn)工藝和質(zhì)量研究等方面的藥學(xué)審評(píng)考慮進(jìn)行闡述, 以期為該類產(chǎn)品的研發(fā)和申報(bào)提供參考。隨著偶聯(lián)策略和分析方法的不斷優(yōu)化和改進(jìn), 更多雙載荷ADC產(chǎn)品進(jìn)入申報(bào)階段, 對(duì)該類產(chǎn)品的理解將逐漸深入, 監(jiān)管機(jī)構(gòu)也將繼續(xù)推進(jìn)指導(dǎo)原則的更新與完善, 雙載荷ADC有望為腫瘤治療帶來(lái)新的突破。