煙草制品中含有一定量的糖類物質(zhì)，如葡萄糖、果糖和麥芽糖等。這些糖類物質(zhì)在燃燒過程中會發(fā)生裂解反應(yīng)，生成呋喃衍生物、酮類及醛類等羰基化合物，能夠賦予煙草獨特的香味特征，明顯改善抽吸口感。相關(guān)研究顯示，向煙草制品中額外添加葡萄糖可以進一步提升煙氣的圓潤性，豐富香氣和味型。因此，建立快速、準(zhǔn)確測定煙草制品中葡萄糖含量的方法，對煙草制品的品質(zhì)控制具有重要意義。
目前測定煙草制品中葡萄糖含量的分析方法較多，但都有其局限性，開發(fā)一種操作簡便、分析高效且成本適中的葡萄糖測定方法成為煙草行業(yè)的迫切需求。
庫侖滴定法作為一種經(jīng)典的電化學(xué)分析方法，具有操作簡便、靈敏度高、分析快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且無需配制標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液等特點，已在化工、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。研究人員基于葡萄糖氧化酶對葡萄糖的特異性催化作用，提出了兩種測定煙草制品中葡萄糖含量的庫侖滴定法，一種是通過測定葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖生成的葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，建立酸堿庫侖滴定法；另一種是通過催化氧化產(chǎn)生的過氧化氫，建立氧化還原庫侖滴定法。該方法系統(tǒng)考察了催化氧化條件、電解質(zhì)溶液濃度等關(guān)鍵試驗參數(shù)對測定結(jié)果的影響，并與HPLC-ELSD進行比對，以期為煙草制品中葡萄糖的高效、準(zhǔn)確測定提供分析方法借鑒。
1 試驗方法
1.1 試驗原理
在有氧環(huán)境下，葡萄糖氧化酶特異性催化氧化葡萄糖，生成葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯和過氧化氫；隨后加入過量的氫氧化鈉使葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯水解為葡萄糖酸鈉，此時體系中同時存在未反應(yīng)的氫氧化鈉和過氧化氫。通過酸堿庫侖滴定法，陽極電解生成的H＋可返滴定剩余的氫氧化鈉，根據(jù)法拉第電解定律計算出上述剩余的氫氧化鈉的含量，進而測得樣品中葡萄糖的含量；通過氧化還原庫侖滴定法，陽極電解生成的 Ce4＋可滴定反應(yīng)生成的過氧化氫，從而間接測得樣品中葡萄糖的含量，兩種方法相互驗證以提高檢測準(zhǔn)確度。涉及的反應(yīng)方程式如式（1）～（6）所示。
1.2 樣品前處理
按照YC/T 31—1996《煙草及煙草制品 試樣的制備和水分測定 烘箱法》方法，將煙草制品樣品置于（40±2）℃烘箱內(nèi)干燥24h，粉碎，過篩。準(zhǔn)確稱取1.0g樣品置于具塞錐形瓶中，加入水，于30℃振蕩萃取，過定性濾紙，得到萃取液。用乙酸溶液調(diào)節(jié)萃取液pH至5.8，加入乙酸鹽緩沖液（pH5.8），于37℃水浴預(yù)熱10min，加入葡萄糖氧化酶溶液，于37℃反應(yīng)，加入氫氧化鈉溶液，混勻，用水定容，即得樣品溶液。
1.3 酸堿庫侖滴定法測定
將鉑片電極、鉑絲電極和pH復(fù)合玻璃電極浸入氯化鉀溶液中，連接庫侖滴定儀后，預(yù)滴定溶液pH至7.0。準(zhǔn)確加入樣品溶液至電解池，攪拌均勻后啟動滴定，自動記錄達到滴定終點（pH7.0）的時間，隨同測定全流程空白溶液，按照公式（7）計算樣品中葡萄糖的含量。
1.4 氧化還原庫侖滴定法測定
將鉑片電極、鉑絲電極和飽和甘汞電極浸入硫酸亞鈰溶液中，連接庫侖滴定儀后，滴加過氧化氫溶液預(yù)滴定至終點。準(zhǔn)確加入樣品溶液至電解池，攪拌均勻后正式滴定，自動記錄達到滴定終點電位的時間，隨同測定全流程空白溶液，按照公式（8）計算樣品中葡萄糖的含量。
2 結(jié)果與討論
2.1 萃取劑及萃取時間的選擇
由于葡萄糖是水溶性單糖，通常采用水、乙酸溶液或氫氧化鈉溶液作為煙草中葡萄糖的萃取劑。試驗以煙草制品樣品 1#、5#、7#為研究對象，采用HPLC-ELSD測定，分別考察了不同萃取劑[（水、5％（體積分數(shù)，下同）乙酸溶液、0.02 mol·L−1 氫氧化鈉溶液）]及不同萃取時間（0.5，1，2，3，4h）對葡萄糖測定結(jié)果的影響，每個條件平行測定5 次，結(jié)果見表1。
結(jié)果顯示：采用水作為萃取劑時，在1～4h萃取時間內(nèi)煙草制品樣品中葡萄糖的測定值保持穩(wěn)定（最大極差為 0.040％）；采用5％乙酸溶液和0.02 mol·L−1氫氧化鈉溶液作為萃取劑時，葡萄糖的測定結(jié)果出現(xiàn)明顯波動（最大極差分別為0.32％，0.13％）。這可能由于在堿性條件下葡萄糖與果糖會發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)，而在酸性條件下蔗糖和麥芽糖可能發(fā)生水解。綜合考慮穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，試驗選擇的萃取劑為水，萃取時間為1h。
2.2 葡萄糖氧化酶質(zhì)量濃度的選擇
試驗以加標(biāo)煙草制品樣品1#（加標(biāo)量為500.0mg·L−1）為研究對象，分別采用酸堿庫侖滴定法和氧化還原庫侖滴定法測定，考察了不同葡萄糖氧化酶質(zhì)量濃度（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5g·L−1）對葡萄糖回收率的影響，每個條件平行測定5次，結(jié)果見表2。
由表2可知：隨著葡萄糖氧化酶質(zhì)量濃度的增大，葡萄糖回收率逐漸增大；當(dāng)葡萄糖氧化酶質(zhì)量濃度大于1.5g·L−1時，葡萄糖回收率接近100％。為確保葡萄糖完全被催化氧化，試驗選擇的葡萄糖氧化酶質(zhì)量濃度為2.0g·L−1。
2.3 催化氧化時間的選擇
葡萄糖氧化酶對葡萄糖的催化氧化程度直接影響其產(chǎn)物的生成量，進而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。試驗以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列為研究對象，分別采用酸堿庫侖滴定法和氧化還原庫侖滴定法測定，考察了不同催化氧化時間（5，10，15，20，25min）對葡萄糖測定結(jié)果的影響，每個條件平行測定5次，結(jié)果見表3。
由表3可知：隨著催化氧化時間的延長，兩種庫侖滴定法測得的葡萄糖的質(zhì)量濃度越來越接近理論值；當(dāng)催化氧化時間超過10min時，兩種庫侖滴定法的測定值與理論值基本一致。為確保樣品中葡萄糖完全被催化氧化，同時兼顧分析效率，試驗選擇的催化氧化時間為20min。
2.4 電解質(zhì)溶液濃度的選擇
由于氯化鉀溶液的分解電位最低，可避免電解過程中的其他副反應(yīng)，因此試驗選擇其作為酸堿庫侖滴定法的支持電解質(zhì)，但電解質(zhì)溶液的濃度會影響離子強度，進而影響電解電流的效率。以加標(biāo)煙草制品樣品1#（加標(biāo)量為200.0mg·L−1）為研究對象，系統(tǒng)考察了不同電解質(zhì)溶液濃度（0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mol·L−1）對葡萄糖回收率的影響。其中考察氯化鉀溶液濃度的影響時，采用酸堿庫侖滴定法測定；考察硫酸亞鈰溶液濃度的影響時，采用氧化還原庫侖滴定法測定，每個條件平行測定5次，結(jié)果見表4。
結(jié)果顯示：當(dāng)電解質(zhì)溶液濃度為0.1mol·L−1時，由于溶液中離子強度不足導(dǎo)致遷移速率較低，無法形成電解回路，進而無法正常完成檢測操作，這與文獻觀察到的現(xiàn)象一致；在酸堿庫侖滴定法中，當(dāng)氯化鉀溶液濃度為0.2，0.4mol·L−1 時，雖可完成滴定過程，但葡萄糖回收率均超出98.0％～102％的范圍，當(dāng)氯化鉀溶液濃度不小于0.6mol·L−1時，葡萄糖回收率則處于上述可接受范圍內(nèi)；在氧化還原庫侖滴定法中，當(dāng)硫酸亞鈰溶液濃度不小于0.8mol·L−1時，葡萄糖回收率同樣符合要求，這可能歸因于電解質(zhì)溶液既作為導(dǎo)電介質(zhì)，又提供電解生成滴定劑所需的反應(yīng)底物。綜上，為節(jié)約試劑消耗量，試驗采用酸堿庫侖滴定法測定時，選擇0.6mol·L−1氯化鉀溶液作為支持電解質(zhì)溶液，采用氧化還原庫侖滴定法測定時，選擇0.8mol·L−1硫酸亞鈰溶液作為支持電解質(zhì)溶液。
2.5 電解電流的選擇
電解電流越大，檢測樣品所需時間越短，但可能會產(chǎn)生較大的隨機誤差；電解電流過小，則會延長分析時間。試驗以 50.0，200.0，800.0mg·L−1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對象，分別采用酸堿庫侖滴定法和氧化還原庫侖滴定法測定，考察了不同電解電流（1.0，5.0，20.0，50.0mA）對葡萄糖測定結(jié)果的影響，每個條件平行測定5次，結(jié)果見表5。
由表5可知：當(dāng)葡萄糖濃度水平一定時，隨著電解電流的增大，滴定時間明顯縮短；在低電解電流條件下，酸堿庫侖滴定法由于所需滴定時間過長而無法完成有效測定，而氧化還原庫侖滴定法則可有效完成測定，且測定值相對誤差的絕對值均小于6.0％；當(dāng)?shù)味〞r間過短（小于30s）時，測定值相對誤差的絕對值較大。因此，試驗采用酸堿庫侖滴定法測定時，選擇的電解電流為20.0～50.0mA，采用氧化還原庫侖滴定法測定時，選擇的電解電流為1.0～5.0mA。
2.6 方法學(xué)考察
2.6.1 專屬性
由于煙草制品樣品中除葡萄糖外，還含有其他糖類物質(zhì)（如果糖、蔗糖、麥芽糖等），這些糖類物質(zhì)可能對檢測過程產(chǎn)生干擾，因此試驗以200.0mg·L−1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和 200.0mg·L−1混合糖類標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對象，分別采用酸堿庫侖滴定法和氧化還原庫侖滴定法測定，考察了兩種庫侖滴定法檢測葡萄糖的專屬性。結(jié)果顯示：采用酸堿庫侖滴定法測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合糖類標(biāo)準(zhǔn)溶液的結(jié)果分別為 198.8，199.5mg·L−1；采用氧化還原庫侖滴定法測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合糖類標(biāo)準(zhǔn)溶液的結(jié)果分別為198.2，199.3mg·L−1，其他糖類物質(zhì)對上述兩種庫侖滴定法均未產(chǎn)生明顯干擾，說明方法具有較好的專屬性。這主要由于在有氧條件下，葡萄糖氧化酶能夠特異性催化氧化葡萄糖，而不會催化氧化其他糖類物質(zhì)。
2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限
分別采用酸堿庫侖滴定法和氧化還原庫侖滴定法測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的滴定時間為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，葡萄糖的質(zhì)量濃度在50.0～800.0mg·L−1內(nèi)和滴定時間呈線性關(guān)系，酸堿庫侖滴定法的線性回歸方程為y=0.986 3x−0.6711，相關(guān)系數(shù)為0.9999；氧化還原庫侖滴定法的線性回歸方程為y=0.9793x＋0.6005，相關(guān)系數(shù)為 0.9997。
連續(xù)測定5次全流程空白溶液，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差s對應(yīng)的質(zhì)量濃度計算檢出限（3s）。結(jié)果顯示，酸堿庫侖滴定法的檢出限為2.04mg·L−1，氧化還原庫侖滴定法的檢出限為3.13mg·L−1。
2.6.3 精密度和回收試驗
對煙草制品樣品1#進行加標(biāo)回收試驗，每個濃度水平平行測定5次，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表6。
結(jié)果顯示，葡萄糖的回收率為 98.1％～103％，測定值的RSD均小于2.0％，說明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。
2.7 方法比對
分別采用酸堿庫侖滴定法、氧化還原庫侖滴定法、YC/T 447—2012中HPLC-ELSD 測定煙草制品樣品1#～10#中葡萄糖的含量，每個樣品平行測定5次，同時在 95％置信度下采用 t 檢驗法對測定結(jié)果進行評價，結(jié)果見表7。
結(jié)果顯示：酸堿庫侖滴定法的測定值與HPLC-ELSD 測定值的最大絕對偏差的絕對值為0.07％，氧化還原庫侖滴定法的測定值與HPLC-ELSD測定值的最大絕對偏差的絕對值為0.08％，說明兩種庫侖滴定法的測定結(jié)果與HPLC-ELSD的具有良好的一致性；酸堿庫侖滴定法的測定結(jié)果普遍略高于HPLC-ELSD的，這可能是由于樣品溶液的弱酸性會消耗部分滴定劑所致；在 95％置信度下t值均小于臨界值 t0.05（4）=2.78，說明兩種庫侖滴定法的測定結(jié)果與HPLC-ELSD的無顯著性差異。
3 試驗結(jié)論
研究人員基于葡萄糖氧化酶對葡萄糖的特異性催化氧化作用，提出了酸堿庫侖滴定法和氧化還原庫侖滴定法測定煙草制品樣品中葡萄糖含量的方法。本方法無需配置昂貴的儀器設(shè)備，大幅降低了分析成本；操作流程簡便，分析快速；具有良好的專屬性，可有效避免其他共存糖類物質(zhì)的干擾；準(zhǔn)確度和精密度良好，靈敏度高，能夠滿足煙草行業(yè)對大批量樣品中葡萄糖含量快速、準(zhǔn)確測定的需求，具有重要的實際應(yīng)用價值。
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