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嘉峪檢測網(wǎng) 2026-01-06 21:26
摘 要： 介紹了糖類物質(zhì)的高效陰離子交換色譜（HPAEC）分離方法及脈沖安培檢測技術(shù)（PAD）的原理，包括流動相選擇、梯度洗脫的優(yōu)勢、離子色譜分離柱類型和應(yīng)用以及脈沖安培檢測技術(shù)的優(yōu)勢。糖類物質(zhì)分析常選用氫氧化鈉溶液和乙酸鈉溶液為流動相，采用梯度洗脫法可顯著提高糖類物質(zhì)的分離效率，不同類型的色譜柱為糖類物質(zhì)分析提供了更多的解決方案，脈沖安培檢測技術(shù)具有極高的靈敏度、可靠性和準(zhǔn)確度。綜述了HPAEC技術(shù)在糖醇、單糖、寡聚糖及多糖分析中的最新應(yīng)用進(jìn)展，包括非食品體系和食品體系及原料中糖類物質(zhì)的檢測，具有操作簡便、靈敏度高、分離度好的優(yōu)勢，同時也為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了一種高效、可靠的分析工具。討論了該技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在復(fù)雜糖類物質(zhì)聚合度分析、糖苷鍵類型鑒定及分支模式研究等方面的優(yōu)勢。展望了離子色譜在糖類物質(zhì)分析中的發(fā)展趨勢，其在結(jié)合定向酶解技術(shù)解析淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)方面具有顯著價值，相關(guān)技術(shù)的優(yōu)化仍是未來發(fā)展的重點(diǎn)方向。該綜述旨在為相關(guān)研究人員在糖類物質(zhì)研究及檢測標(biāo)準(zhǔn)制定方面提供技術(shù)參考。
關(guān)鍵詞： 高效陰離子交換色譜； 糖類物質(zhì)； 碳水化合物； 脈沖安培檢測； 質(zhì)譜檢測
糖類物質(zhì)(亦稱碳水化合物)包括單糖、寡聚糖、多糖、糖類衍生物和結(jié)合糖等，廣泛存在于植物、動物、微生物及環(huán)境中。在生命科學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)及農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域，糖類物質(zhì)的分析具有重要意義，因此，針對糖類分析方法的研究與優(yōu)化日益受到關(guān)注[1?6]。然而，由于糖類物質(zhì)種類繁多、結(jié)構(gòu)相似，且通常缺乏化學(xué)發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，其精確定量及結(jié)構(gòu)分析面臨諸多挑戰(zhàn)。目前，色譜技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)是糖類物質(zhì)分析的主要手段，常結(jié)合其他檢測技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用[7?8]。在色譜分離技術(shù)中，氣相色譜(GC)法需要進(jìn)行衍生化處理，操作復(fù)雜且準(zhǔn)確性受到衍生化效率的較大影響；毛細(xì)管電泳(CE)法同樣需要衍生化處理后才能進(jìn)行紫外吸收測定；液相色譜(HPLC)與紫外(UV)或熒光(FLD)檢測技術(shù)聯(lián)用時也需要衍生化處理，而與示差折光(RID)或蒸發(fā)光散射(ELSD)檢測技術(shù)聯(lián)用盡管無須衍生化預(yù)處理，但其選擇性較差、靈敏度低，且無法進(jìn)行梯度洗脫，從而限制了其應(yīng)用范圍；液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的分析方法則存在樣品處理步驟復(fù)雜、分析耗時長、需要昂貴的標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物等缺點(diǎn)[9?14]。此外，上述方法也無法實現(xiàn)糖類物質(zhì)異構(gòu)體的分離。
隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，一種更為先進(jìn)的檢測方法——高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(HPAEC-PAD)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并在糖類物質(zhì)分析領(lǐng)域取得了顯著突破[15]。該方法無須復(fù)雜的衍生化處理，且具有優(yōu)異的分離度和高靈敏度。通過優(yōu)化色譜柱型號和分析條件，HPAEC-PAD能夠?qū)崿F(xiàn)多種糖類物質(zhì)的同步分離與定量檢測，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及生物科學(xué)領(lǐng)域。例如，該方法已成為乳制品和蜂蜜等食品中的糖分分析，以及疫苗生產(chǎn)中質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)分析方法[16]。目前，在食品和煙草行業(yè)中，HPAEC-PAD已被納入多項國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。例如，中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21533—2008《蜂蜜中淀粉糖漿的測定 離子色譜法》、GB/T 23780—2009《糕點(diǎn)中總糖的測定 離子色譜法》，煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 283—2009《煙草及煙草制品 淀粉的測定 酶水解-離子色譜法》、YC/T 251—2008《煙草及煙草制品 葡萄糖、果糖、蔗糖的測定 離子色譜法》、YC/T 252—2008《煙用料液 葡萄糖、果糖、蔗糖的測定 離子色譜法》、YC/T 346—2010《煙草及煙草制品 果膠的測定 離子色譜法》以及農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NT/T 2279—2012《食用菌中巖藻糖、阿糖醇、海藻糖、甘露醇、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖的測定 離子色譜法》。此外，國際官方分析合作協(xié)會(AOAC International)也發(fā)布了多項基于離子色譜技術(shù)的國際標(biāo)準(zhǔn)方法，用于食品中糖類物質(zhì)的測定。HPAEC-PAD憑借其高效性和準(zhǔn)確性，已成為糖類物質(zhì)分析領(lǐng)域的重要工具。筆者系統(tǒng)介紹了HPAEC-PAD在糖類物質(zhì)檢測中的技術(shù)原理及最新研究進(jìn)展，并對近年來的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)領(lǐng)域研究人員在糖類物質(zhì)的檢測與分析中提供有價值的技術(shù)參考與理論支持。
1 技術(shù)原理
多數(shù)糖類物質(zhì)具有親水性和弱酸性，其解離常數(shù)(pKa)通常在12～14之間。單糖不同位置的羥基，其酸性存在差異，例如在葡萄糖分子中，羥基的酸性強(qiáng)度由大到小依次為1-OH、2-OH/6-OH、3-OH、4-OH。糖類物質(zhì)的酸性越強(qiáng)，與陰離子交換色譜柱的結(jié)合越緊密。在強(qiáng)堿性溶液環(huán)境中，OH-離子可促進(jìn)糖類物質(zhì)中的羥基發(fā)生酸性解離，使其轉(zhuǎn)變?yōu)殛庪x子狀態(tài)，從而增強(qiáng)其在陰離子交換色譜柱上的保留能力。糖類物質(zhì)的保留能力受到多種因素的影響，包括其帶電荷數(shù)、pKa值、羥基數(shù)量、聚合度、分子組成及構(gòu)型等。通過調(diào)節(jié)流動相的濃度與組成，以及優(yōu)化色譜柱和運(yùn)行條件，可以實現(xiàn)糖類物質(zhì)的高效分離[17?18]。
1.1 流動相
采用離子色譜分離糖類物質(zhì)時，常用的流動相為氫氧化鈉溶液和乙酸鈉溶液。為確保分析精度，配制流動相時需使用電阻率大于18.25 MΩ·cm的超純?nèi)ルx子水，并且避免微生物污染。氫氧化鈉溶液易吸收空氣中的二氧化碳，生成碳酸根離子，這會引發(fā)強(qiáng)洗脫效應(yīng)，導(dǎo)致糖類物質(zhì)的保留時間縮短并降低分離效果，因此，配制好的流動相需進(jìn)行脫氣，并利用惰性氣體(如氮?dú)饣蚝?保護(hù)，以隔絕空氣中二氧化碳的干擾。此外，使用市售的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%氫氧化鈉溶液配制流動相，可以有效避免用氫氧化鈉固體顆粒配制過程中顆粒表面生成的碳酸根離子污染流動相[19]。對于單糖至四糖及其相應(yīng)的糖醇類物質(zhì)，僅使用氫氧化鈉溶液作為流動相即可實現(xiàn)有效洗脫。然而，對于保留能力較強(qiáng)的糖類物質(zhì)，往往需要引入具有更強(qiáng)親和力的“助推”陰離子，如乙酸根或硝酸根。近年來，采用淋洗液發(fā)生裝置生成的甲磺酸根(MSA)作為“助推”陰離子也取得了良好的效果[20]。
1.2 梯度洗脫
高效陰離子交換色譜采用梯度洗脫方法顯著提高了糖類物質(zhì)的分離效率，并有效縮短了分離時間，不同糖類物質(zhì)的分離度隨著氫氧化鈉溶液濃度的變化而發(fā)生顯著變化。使用氫氧化鈉溶液梯度洗脫能夠高效分離小分子糖類物質(zhì)。具體而言，提高氫氧化鈉溶液濃度有助于改善中性大分子寡聚糖的分離效果，而較低濃度的氫氧化鈉溶液則有利于高效分離低相對分子質(zhì)量的中性寡聚糖。此外，隨著強(qiáng)堿性季銨鹽樹脂色譜柱的廣泛應(yīng)用，以純水作為流動相也逐漸受到關(guān)注[19]。梯度洗脫策略增強(qiáng)了糖類物質(zhì)的分離效果，為復(fù)雜樣品中糖類物質(zhì)成分的定量分析提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。
1.3 離子色譜分離柱
目前，應(yīng)用于糖類化合物分析的色譜柱主要以美國賽默飛世爾公司推出的CarboPac系列產(chǎn)品為代表。最早商業(yè)化的CarboPac PA1色譜柱，基于苯乙烯-二乙烯基苯聚合物和膜狀陰離子交換介質(zhì)，主要應(yīng)用于單糖、小分子寡聚糖和部分糖醇的分離分析。然而，該色譜柱不兼容有機(jī)溶劑，并且在低氫氧根濃度條件下靈敏度較低，限制了其在復(fù)雜樣品中的應(yīng)用。為克服PA1的局限性，賽默飛世爾公司開發(fā)了CarboPac PA10色譜柱，該色譜柱在不同濃度的氫氧根條件下均具有較高的靈敏度，并且適用于大部分有機(jī)溶劑。針對寡聚糖和多糖的分析，CarboPac PA100色譜柱應(yīng)運(yùn)而生。該色譜柱不僅能夠適應(yīng)所有有機(jī)溶劑，而且在不同氫氧根濃度下表現(xiàn)出良好的靈敏度。然而，由于PA100無法分離差向異構(gòu)體，因此不適用于單糖和二糖的分離分析。隨著對糖類物質(zhì)分離需求的不斷提高，賽默飛世爾公司進(jìn)一步推出了CarboPac PA20和PA200色譜柱。CarboPac PA20在單糖分離方面提供了更高的分辨率，而CarboPac PA200則顯著提高了寡聚糖和多糖的分離分辨率。此外，對于保留能力較弱的還原性單糖、二糖及糖醇類物質(zhì)，CarboPac MA1色譜柱憑借其更高的陰離子交換容量，提供了更好的保留性能。表1列出了常用CarboPac系列色譜柱的主要應(yīng)用范圍、填充樹脂粒徑、流量及其主要局限性[21]。除了賽默飛世爾公司的CarboPac系列色譜柱外，瑞士萬通公司和哈密頓公司也推出了專門用于糖類物質(zhì)分離的色譜柱。這些產(chǎn)品的多樣性進(jìn)一步豐富了糖類物質(zhì)分析的選擇，為研究人員在復(fù)雜樣品檢測和高效分離中提供了更多解決方案。
表1 常用的CarboPac系列糖分離色譜柱
Tab. 1 Common Carbopac series chromatographic columns for sugar separation
1.4 脈沖安培檢測
大多糖類化合物缺乏在線檢測所需的生色團(tuán)或熒光基團(tuán)，使得其分析較為困難。然而，糖類化合物通常具有電化學(xué)活性，這為采用電化學(xué)方法進(jìn)行檢測提供了理論基礎(chǔ)。然而，由于糖類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物容易污染工作金屬電極表面，傳統(tǒng)的金屬電極安培檢測法并不適用于糖類物質(zhì)的在線分析。PAD的開發(fā)在一定程度上彌補(bǔ)了上述缺陷，該技術(shù)能夠在酸性或堿性條件下精確檢測糖類化合物。經(jīng)過不斷優(yōu)化，目前廣泛采用的四電位波形方法(如圖1所示)有效避免了電極表面金屬損失及電信號衰減的問題。該方法顯著延長了電極壽命，并顯著提高了數(shù)據(jù)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。盡管循環(huán)脈沖安培檢測技術(shù)已顯著改善了糖類分析的效果，但在使用一段時間后，電極表面仍會發(fā)生污染，因此需要定期進(jìn)行清洗和打磨，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
圖1 用于糖類物質(zhì)檢測的四電位波形圖
Fig. 1 Four potential waveform of pulsed amperometric detection for carbohydrate analysis
E1—檢測電位； E2—清潔電位； E3—活化電位； E4—氧化還原電位
雖然可拋型電極、銀-氯化銀參比電極和氫鈀電極等技術(shù)的開發(fā)有效避免了電極污染和信號衰減等問題，但這些技術(shù)的應(yīng)用也顯著增加了檢測成本，因此，在實際應(yīng)用中，研究人員通常會根據(jù)具體分析需求來選擇合適的電極類型。此外，電化學(xué)信號的檢測還受溫度和檢測池體積的影響。為提高檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，現(xiàn)代HPAEC-PAD系統(tǒng)通常配備色譜柱和檢測池的溫度控制系統(tǒng)[16,19]。脈沖安培檢測技術(shù)在分辨率、選擇性和靈敏度等方面具有無可比擬的優(yōu)勢[20]。離子色譜與脈沖安培檢測技術(shù)聯(lián)用，無須進(jìn)行樣品衍生化、也無需使用有機(jī)溶劑作為流動相，且樣品處理簡單，因此在糖類物質(zhì)的分析中得到了廣泛應(yīng)用[22]。HPAEC-PAD的電化學(xué)檢測具有非常寬的線性范圍，例如葡萄糖的檢測范圍可達(dá)到4個數(shù)量級。隨著檢測池設(shè)計和脈沖波形優(yōu)化的不斷發(fā)展，分析靈敏度也在持續(xù)提升。對于許多分析物，其靈敏度已可達(dá)到低于1 pmol的水平。在乳糖殘留檢測中，相較于分光光度法、酶解法、液相色譜-示差折光聯(lián)用法和生物傳感器法等傳統(tǒng)方法，HPAEC-PAD技術(shù)不受其他二糖物質(zhì)的干擾，展現(xiàn)出極高的靈敏度、可靠性和準(zhǔn)確性[23]。在α-淀粉酶活性抑制研究中，HPAEC-PAD技術(shù)已成功應(yīng)用于酶解產(chǎn)物的定量分析，具有高靈敏度、選擇性、專一性和準(zhǔn)確性[24]，并已用于人體關(guān)鍵碳水化合物消化酶活性分析研究[16]。未來，針對不同的分析對象，可以在檢測池設(shè)計、脈沖波形優(yōu)化、檢測條件設(shè)置以及樣品處理等方面進(jìn)一步探索，以提升HPAEC-PAD技術(shù)在糖類物質(zhì)分析中的應(yīng)用潛力。
2 離子色譜技術(shù)在糖類化合物分析中的應(yīng)用進(jìn)展
2.1 在糖醇、單糖及二糖分析中的應(yīng)用
糖醇是一類由糖分子通過加氫還原反應(yīng)生成的多元醇，其形成機(jī)制是將糖分子中的醛基或酮基還原為羥基。由于糖醇類物質(zhì)不易引發(fā)齲齒，不會顯著升高血糖水平，并能為糖尿病患者提供一定的熱量，因此在食品和飲料行業(yè)中被廣泛用作營養(yǎng)甜味劑。然而，由于糖醇的酸性較其前體糖類物質(zhì)弱，其在陰離子交換色譜柱上的保留能力較低。為了提高保留能力和分辨率，通常需要選擇柱容量較高的分離柱，并使用強(qiáng)堿溶液作為流動相。在單糖和二糖的分析中，常采用稀堿溶液作為流動相，且堿濃度越低，分離選擇性越高。有些研究者甚至嘗試使用純水作為流動相，但在這種情況下，為恢復(fù)色譜柱的全部離子交換能力，需要定期用高濃度的氫氧化鈉溶液進(jìn)行沖洗[25]。此外，為了保持金電極對糖類物質(zhì)氧化的電化學(xué)活性，還需在柱后加堿以活化電極。通過上述優(yōu)化手段，可以顯著提高HPAEC-PAD技術(shù)對糖醇類物質(zhì)的分離效率和檢測靈敏度，從而為食品、飲料及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的糖醇分析提供可靠的技術(shù)支持。
2.1.1 用于非食品體系糖類物質(zhì)的分析
稻瘟病菌在滲透脅迫、殺菌劑脅迫響應(yīng)以及不同發(fā)育階段中分泌低濃度的阿糖醇、甘油、甘露醇和海藻糖等糖類物質(zhì)。這些糖類物質(zhì)在病原菌的細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，因此，靈敏且準(zhǔn)確的分析方法對于深入研究稻瘟病菌的代謝機(jī)制至關(guān)重要。Grünewald等[26]開發(fā)了一種基于HPAEC-PAD技術(shù)的方法，能夠同時檢測稻瘟病菌樣品中甘油、赤蘚糖醇、阿糖醇、山梨醇、海藻糖、甘露醇以及葡萄糖。方法采用CarboPac MA1分析柱，以480 mmol/L NaOH溶液作為流動相，流量為0.4 mL/min，進(jìn)行等度洗脫。該方法不僅具有良好的分離效果，而且檢測結(jié)果可靠且重復(fù)性高。通過該技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確且全面地分析稻瘟病菌代謝過程中涉及的多種糖類物質(zhì)，從而為研究其在環(huán)境脅迫和病理學(xué)過程中的代謝調(diào)節(jié)提供了有力的工具。糖類化合物廣泛存在于陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)中，其分子水平的檢測對于揭示不同生物地球化學(xué)特征具有一定意義。Nouara等[27]利用HPAEC-PAD技術(shù)對海洋和大氣樣品中的中性糖、糖醇和脫水糖進(jìn)行了分析。通過優(yōu)化色譜柱類型、流量、流動相濃度以及色譜柱溫度等實驗條件，建立了一種可在75 min內(nèi)同時檢測樣品中15種糖類物質(zhì)(包括木糖醇、內(nèi)醚糖、阿拉伯糖醇、巖藻糖/鼠李糖、山梨醇、甘露糖、甘露醇、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖和核糖)的方法。方法使用CarboPac MA1分析柱，并采用250～700 mmol/L的NaOH溶液進(jìn)行梯度洗脫，流量為0.3 mL/min。此外，通過色譜柱溫度梯度優(yōu)化，即分析初始30 min內(nèi)，色譜柱溫度逐步從25 ℃升至28 ℃，然后保持在28 ℃至分析結(jié)束。該方法對于各中性糖、糖醇和脫水糖的檢出限分別為4～51、2～15、8～32 nmol/L，且所有單糖在50 nmol/L至10 μmol/L濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。該方法具有較高的靈敏度和可靠性，能夠有效提升對海洋和陸地生態(tài)系統(tǒng)中糖類物質(zhì)動態(tài)變化的認(rèn)知。國內(nèi)學(xué)者刀谞等[28]也建立了一種基于HPAEC-PAD的快速檢測方法，用于大氣顆粒物(PM2.5、PM10)中的丙三醇、赤蘚糖醇、木糖醇、左旋葡聚糖、山梨醇、甘露聚糖、海藻糖、甘露醇、半乳聚糖、葡萄糖共計10種糖類物質(zhì)的定量分析。該方法同樣使用CarboPac MA1分析柱，但采用250～500 mmol/L的NaOH溶液進(jìn)行梯度洗脫，流量為0.4 mL/min。與國外研究相比，國內(nèi)方法在流動相濃度梯度和流量方面有所不同，最終獲得的10種物質(zhì)的檢出限為0.01～0.04 ng/m3，優(yōu)于傳統(tǒng)的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。且該方法具有快速、靈敏、穩(wěn)定且可靠的特點(diǎn)，能夠滿足大氣顆粒物中糖類和糖醇類物質(zhì)的檢測需求。這兩項研究充分展示了HPAEC-PAD技術(shù)在環(huán)境樣品糖類物質(zhì)分析中的應(yīng)用潛力，并為進(jìn)一步研究生態(tài)系統(tǒng)中的糖類代謝提供了重要的技術(shù)支持。卷煙原料中糖類和糖醇類物質(zhì)的含量對成品煙的品質(zhì)具有重要影響。張濤等[29]自主設(shè)計了樣品萃取瓶，通過超聲萃取法提取煙草樣品，并結(jié)合固相萃取柱進(jìn)行在線凈化，大幅提高了樣品前處理效率。在隨后的試驗中使用HPAEC-PAD技術(shù)快速分析了煙草樣品中的3種糖類物質(zhì)(葡萄糖、果糖和蔗糖)。由于不需要測定糖醇類保潤成分，選擇了CarboPac PA1分析柱，并以200 mmol/L氫氧化鈉溶液為流動相，在10 min內(nèi)完成了目標(biāo)糖類物質(zhì)的測定。該方法各糖類物質(zhì)的檢出限為1.0～1.6 mg/L、定量限為3.2～5.4 mg/L，實現(xiàn)了3種糖類物質(zhì)的快速、準(zhǔn)確且高通量分析。上述研究展示了HPAEC-PAD技術(shù)在卷煙原料分析中的應(yīng)用潛力，不僅提高了檢測效率，還確保了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，為提升卷煙品質(zhì)提供了可靠的技術(shù)支撐。
2.1.2 用于食品體系及原料中糖類物質(zhì)的分析
針對牛奶及其制品中多種單糖和二糖缺乏同步檢測標(biāo)準(zhǔn)化方法的現(xiàn)狀，Brunt等[30]開發(fā)了一種基于HPAEC-PAD的標(biāo)準(zhǔn)分析方法(ISO/WD 22184 & IDF/WD 244)。該方法經(jīng)過新西蘭、美國及歐洲13個不同實驗室的聯(lián)合驗證和改進(jìn)，結(jié)果表明其準(zhǔn)確度極高，已被國際乳品聯(lián)合會(IDF)和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)正式采納[31]。該方法使用CarboPac PA1分析柱，通過NaOH/NaAc (氫氧化鈉/乙酸鈉)溶液梯度洗脫，并在柱后添加高濃度NaOH溶液以活化電極，從而提高電極的靈敏度及穩(wěn)定性。該方法能夠同步準(zhǔn)確測定牛奶及其制品中的多種糖類物質(zhì)，包括半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及麥芽糖。這一標(biāo)準(zhǔn)化方法的建立，不僅提高了糖類物質(zhì)檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，也為全球乳制品行業(yè)提供了統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，有助于提升產(chǎn)品質(zhì)量和安全性。黃酒中含有葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、核糖、乳糖等糖類物質(zhì)，其含量受所采用的釀造原料和工藝的影響，因此，對黃酒中的糖類物質(zhì)進(jìn)行精確檢測，對于黃酒品質(zhì)的監(jiān)控具有重要意義。徐諾等[8]建立了一種基于HPAEC-PAD的分析方法，用于同時檢測黃酒中的阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、核糖和乳糖。該方法選用了CarboPac PA10分析柱，以NaOH/NaAc溶液為淋洗液進(jìn)行梯度洗脫，流量為1.0 mL/min、色譜柱溫度為30 ℃。在20 min內(nèi)，成功實現(xiàn)了6種糖類物質(zhì)的分離，各糖類物質(zhì)的檢出限為2.99×10-3～1.38×10-2 μg/mL，定量限為9.96×10-3～4.60×10-2 μg/mL。宋衛(wèi)得等[32]通過優(yōu)化流量、淋洗液濃度和色譜柱溫度等實驗條件，獲得了適于糖、糖醇及醇類物質(zhì)同時檢測的色譜分析方法。該方法通過HPAEC-PAD成功實現(xiàn)了啤酒中23種糖、糖醇和醇類物質(zhì)的同時測定。優(yōu)化后的實驗條件：流量為0.45 mL/min，NaOH淋洗液濃度為480 mmol/L，CarboPac MA1色譜柱溫度為29 ℃。在優(yōu)化的條件下，23種組分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其中21種組分的檢出限為0.011～0.197 mg/L。該方法具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，完全適用于啤酒釀造、質(zhì)量控制和安全監(jiān)管等過程中多種糖、糖醇及醇類的快速分析。上述研究表明，相較于CarboPac MA1分析柱，CarboPac PA10分析柱具有更低的檢出限和更高的靈敏度，尤其適用于黃酒中糖類物質(zhì)的檢測。近年來，HPAEC-PAD技術(shù)結(jié)合相應(yīng)色譜柱(CarboPac MA1、CarboPac PA1、CarboPac PA10、Metrosep Carb 2)和合適的流動相條件，廣泛應(yīng)用于各種樣品中糖類物質(zhì)的檢測。該技術(shù)在多個領(lǐng)域的應(yīng)用取得了顯著成效。例如，HPAEC-PAD已成功應(yīng)用于檢測洋常春藤中的游離糖[33]，果汁中的22種糖、糖醇和醇[10]，市售食品中的9種糖和糖醇[34]，黑果腺肋花楸果中的8種單糖和雙糖[9]，毛竹竹葉中的單糖和糖醛酸[35]，市售常見蔬菜中7種單糖和雙糖[36]，蜂蜜樣品中的松二糖[37]，牛肉水解產(chǎn)物中的6種糖組分[38]，調(diào)制乳粉和固體飲料中的異麥芽糖、異麥芽三糖和潘糖[39]，以及甘薯原料中包括葡萄糖、果糖、蔗糖麥芽糖等在內(nèi)的10種可溶性糖[40]。這些研究表明，通過優(yōu)化樣品處理條件，HPAEC-PAD技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對復(fù)雜樣品中糖類物質(zhì)的高效檢測。該方法操作簡便、靈敏度高、分離度好，且具有較高的準(zhǔn)確性和快速性，相較于其他分析方法，展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，尤其在多種糖類物質(zhì)的檢測中，顯示了其優(yōu)越性。
2.2 在寡聚糖和多糖分析中的應(yīng)用
食品中的碳水化合物可分簡單碳水化合物和復(fù)雜碳水化合物兩大類。簡單碳水化合物包括任何可溶、可消化且可吸收的糖類物質(zhì)，如單糖、雙糖和糖醇。復(fù)雜碳水化合物則包括寡聚糖和多糖，如淀粉、纖維素、半纖維素、果膠、樹膠、果聚糖、低聚木糖和低聚半乳糖等。糖類物質(zhì)的精確定量在食品成分評估、產(chǎn)品營養(yǎng)價值評價、食品技術(shù)和加工過程分析、食品來源真實性與摻假控制，以及儲存期間產(chǎn)品質(zhì)量控制等方面至關(guān)重要。此外，準(zhǔn)確分析淀粉酶解后的寡聚糖及多聚葡糖類產(chǎn)物，對于糧食發(fā)酵糖化過程的有效監(jiān)控以及淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的深入研究也具有重要的科學(xué)和實踐意義。
2.2.1 分離條件
選擇寡聚糖是由單糖分子通過糖苷鍵連接而成的，但僅通過推斷單糖羥基的酸度等級并不能直接預(yù)測寡聚糖在離子色譜柱上的保留行為。盡管寡聚糖的同系物中，容量因子通常隨著鏈長的增加而呈現(xiàn)規(guī)則且可預(yù)測的增大趨勢，但除了鏈長和糖類組分外，糖苷鍵的連接位置也會顯著影響寡聚糖的色譜保留行為，因此，寡聚糖的分析通常需要使用強(qiáng)陰離子交換色譜柱，如CarboPac PA100和CarboPac PA200。為了有效洗脫寡聚糖和聚合度最高達(dá)85的多糖，通常需要使用比氫氧化鈉溶液洗脫能力更強(qiáng)的洗脫液。在相關(guān)分析中，通常選擇乙酸鈉溶液為洗脫液，但由于電化學(xué)檢測需要在強(qiáng)堿性環(huán)境下進(jìn)行，仍需使用氫氧化鈉溶液以保持適宜的檢測條件。大多數(shù)寡聚糖的分離通常選擇恒定濃度的氫氧化鈉溶液和梯度濃度的乙酸鈉溶液組合為洗脫液。
2.2.2 用于產(chǎn)品質(zhì)量控制
糊精是制藥工業(yè)中的重要輔料，其還原糖組分和含量直接影響原料藥的活性，因此，對糊精中的還原糖進(jìn)行準(zhǔn)確測定是有效監(jiān)控其質(zhì)量的重要手段。李藝等[41]建立了一種HPAEC-PAD方法，用于分離和測定糊精中的還原糖。方法使用CarboPac PA200色譜柱，并采用由純水、氫氧化鈉溶液和乙酸鈉溶液組成的三相流動體系進(jìn)行梯度洗脫，流量為0.4 mL/min，色譜柱溫度為30 ℃。在30 min內(nèi)成功定量分析了糊精中的5種還原糖，包括葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖，各還原糖的檢出限為2.2～3.7 ng/mL，定量限為7.5～12.3 ng/mL。該方法不僅具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，還具備操作簡便、快速高效的優(yōu)點(diǎn)，為糊精質(zhì)量控制提供了一種可靠的分析工具。β-環(huán)糊精是由7個葡萄糖分子通過α-1，4糖苷鍵連接形成的環(huán)狀低聚糖，通常由淀粉的酶轉(zhuǎn)化過程生成。它作為藥物的載體材料和緩釋材料，能夠提高藥物的穩(wěn)定性和生物利用度。然而，在酶解轉(zhuǎn)化過程中，可能產(chǎn)生其他糖類化合物雜質(zhì)，影響產(chǎn)品的純度和質(zhì)量。王淼等[42]采用HPAEC-PAD技術(shù)對β-環(huán)糊精樣品中的糖類雜質(zhì)進(jìn)行檢測。實驗使用CarboPac PA200色譜柱，在30 ℃柱溫和0.45 mL/min的流量條件下，采用純水-NaOH溶液-NaAc溶液三相流動體系梯度洗脫。成功檢測了β-環(huán)糊精樣品中的α-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、葡萄糖和麥芽糖等雜質(zhì)。該方法對單糖和二糖的檢出限為0.02 μg/mL，對糊精的檢出限為0.2～0.5 μg/mL；單糖和二糖的定量限為0.03～0.05 μg/mL，糊精的定量限為0.4～1.0 μg/mL。所建立的方法不僅具有高靈敏度，還表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。然而，盡管積分脈沖安培檢測在氨基酸分析中廣泛應(yīng)用，但研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)該方法用于糖類物質(zhì)檢測時，其靈敏度仍遜于傳統(tǒng)的脈沖安培檢測法。殼寡糖是殼聚糖水解形成的低聚物，廣泛應(yīng)用于保健品、營養(yǎng)劑、食品和飼料添加劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等領(lǐng)域。尤其是相對分子質(zhì)量低于10 000的殼寡糖，因其獨(dú)特的生理和功能特性而備受關(guān)注。邵波等[43]選擇CarboPac PA10色譜柱，以氫氧化鈉溶液為流動相等度洗脫，流量為0.6 mL/min，色譜柱和檢測池溫度均為30 ℃，成功建立了一種快速檢測殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖5種殼寡糖含量的HPAEC-PAD分析方法。糖類物質(zhì)在離子色譜上分離是基于陰離子交換分離模式，但在進(jìn)行殼寡糖分離時，由于其分子帶有氨基基團(tuán)，在堿性洗脫液中帶正電荷，從而部分中和了糖類物質(zhì)的陰離子，削弱了其離子電荷數(shù)，因此，與常規(guī)糖類物質(zhì)在離子色譜上的出峰順序相反，殼寡糖的出峰順序依次為殼六糖、殼五糖、殼四糖、殼三糖和殼二糖。該方法具有較高的靈敏度和良好的線性范圍，其檢出限為0.2～0.8 μg/mL，質(zhì)量濃度線性范圍為2～10 μg/mL，不僅簡便快速，而且準(zhǔn)確性高，適用于殼寡糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制和成分分析。功能性低聚糖是一類由2至10個相同或不同單糖通過糖苷鍵連接而成的聚糖類物質(zhì)，具有被腸道內(nèi)有益菌選擇性利用的特點(diǎn)，并展現(xiàn)出多種生理功能。準(zhǔn)確檢測功能性低聚糖的含量對于產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控具有重要意義。朱偉等[44]開發(fā)了一種HPAEC-PAD檢測方法，可同時測定蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖以及毛蕊花糖。方法使用CarboPac PA20色譜柱，在30 ℃的柱溫條件下，以NaOH-NaAc溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流量為0.45 mL/min。結(jié)果表明，該方法對各類低聚糖的檢出限為0.2～0.5 mg/g，具有操作簡便、快速且準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，不僅適用于功能性低聚糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制，還能為功能性食品的研發(fā)和檢測提供可靠的數(shù)據(jù)支持。對木聚糖酶降解谷物原料所產(chǎn)生的單糖和功能性低聚糖進(jìn)行準(zhǔn)確定量，對于促進(jìn)食品和飼料用相關(guān)酶制劑的開發(fā)、提升人類和動物健康水平具有重要意義。Alyassin等[45]采用CarboPac PA200色譜柱，并結(jié)合NaOH-NaAc溶液梯度洗脫法，建立了可同時快速準(zhǔn)確定量谷物中單糖、低聚木糖、阿拉伯低聚木糖以及糖醛酸的離子色譜檢測方法。單糖和低聚糖的檢出限為0.001～0.3 mg/L、定量限為0.008～0.5 mg/L。該方法不僅能夠表征木聚糖降解酶的活性，還能揭示木聚糖酶作用下谷物原料過程中木聚寡糖糖譜的動態(tài)變化規(guī)律。此外，類似的離子色譜檢測方法已成功應(yīng)用于多個領(lǐng)域：如甘露聚糖酶處理后咖啡廢渣中甘露寡聚糖的組分及含量測定[46]，酸面團(tuán)發(fā)酵過程中果聚糖酶解產(chǎn)物的分析[47]，燕麥發(fā)酵飲品體外消化處理后的寡聚糖組成研究[48]，以及低聚半乳糖原料中半乳糖、葡萄糖、乳糖和低聚半乳糖的同時定量[49]。Pöhnl等[50]采用HPAEC-PAD法和超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(UHPLC-ELSD)法，分析了不同洋蔥品種中的低聚果糖組分及含量。研究結(jié)果表明，HPAEC-PAD在糖類物質(zhì)的檢測種類、檢出限等方面具有顯著優(yōu)勢。褐藻膠經(jīng)裂解得到的褐藻寡糖，因其具備抗氧化、抑菌、抗癌及免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性而備受關(guān)注。相較于傳統(tǒng)的化學(xué)水解方法，酶法生產(chǎn)褐藻寡糖具有反應(yīng)條件溫和、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物得率高等優(yōu)勢。江君等[51]采用離子色譜技術(shù)，對枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)的黃桿菌褐藻膠裂解酶制備所得的褐藻寡糖的相對含量進(jìn)行了分析。研究結(jié)果顯示，在二至八糖系列中，三糖占比最高，七糖占比最低。該研究不僅揭示了褐藻膠裂解過程中不同寡糖組分的分布規(guī)律，還為進(jìn)一步探索褐藻寡糖的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系及其在食品、醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的數(shù)據(jù)支持。離子色譜技術(shù)憑借其高效分離能力和高靈敏度，成為分析復(fù)雜寡糖組分的重要手段。通過優(yōu)化色譜參數(shù)，該方法能夠準(zhǔn)確定量不同聚合度的褐藻寡糖，為功能性褐藻寡糖產(chǎn)品的開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。
2.2.3 用于淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)
研究采用HPAEC-PAD結(jié)合淀粉定向酶解技術(shù)，在淀粉化學(xué)精細(xì)結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域已取得了顯著進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，支鏈淀粉的鏈長分布具有階段性特征，據(jù)此可將其分為4個組分：fa (聚合度為6～12)、fb1 (聚合度為13～24)、fb2 (聚合度為25～36)、fb3 (聚合度大于36)(如圖2所示)[52]，這為將支鏈淀粉鏈長分布作為淀粉化學(xué)結(jié)構(gòu)分析的重要手段奠定了基礎(chǔ)。Kong等[53]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，支鏈淀粉的鏈長分布特征與淀粉的理化特性及功能特性顯著相關(guān)，為解析淀粉結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供了重要依據(jù)。然而，僅通過鏈長分布數(shù)據(jù)，難以深入了解支鏈淀粉內(nèi)部的鏈接特征。針對這一問題，Bertoft等[54]采用淀粉酶定向酶解技術(shù)，并結(jié)合HPAEC-PAD分析，進(jìn)一步解析了支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)。在相關(guān)分析技術(shù)構(gòu)建的基礎(chǔ)之上，Wang等[55]建立了支鏈淀粉鏈構(gòu)造特征模型，為深入了解淀粉的分子結(jié)構(gòu)及其功能特性提供了強(qiáng)有力的支持。HPAEC-PAD技術(shù)憑借其高分辨率、高靈敏度和良好的重現(xiàn)性，已成為研究淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的核心工具。
fa—聚合度為6～12； fb1—聚合度為13～24；fb2—聚合度為25～36； fb3—聚合度大于36圖2 典型支鏈淀粉鏈長分布圖
Fig. 2 Typical chain-length distribution profile of amylopectin
2.3 離子色譜與質(zhì)譜檢測技術(shù)聯(lián)用研究進(jìn)展
在糖類物質(zhì)分析中，離子色譜結(jié)合脈沖安培檢測器是目前最常用的檢測方式。然而，為滿足特定分析需求，離子色譜與其他檢測器的聯(lián)用逐漸受到關(guān)注。例如，離子交換色譜與質(zhì)譜聯(lián)用可提供葡聚寡糖的結(jié)構(gòu)信息，并揭示葡聚糖的分支模式。質(zhì)譜檢測器作為一種高靈敏度、高分辨率的通用型檢測器，具備強(qiáng)大的定性能力[56]，但其與離子色譜聯(lián)用時存在一定的技術(shù)挑戰(zhàn)。離子色譜通常采用高堿性流動相(如NaOH溶液)，這可能會影響離子化效率，并對質(zhì)譜儀的離子源造成損害，因此，在離子色譜與質(zhì)譜聯(lián)用時，通常通過在線脫鹽抑制器來去除流動相中的堿性成分，以確保質(zhì)譜檢測的穩(wěn)定性和靈敏度[57]。此外，隨著新型強(qiáng)季銨鹽樹脂色譜柱的研發(fā)，離子色譜可采用純水作為流動相，從而降低對質(zhì)譜儀的影響，提高聯(lián)用系統(tǒng)的適配性。這一技術(shù)進(jìn)展極大地拓展了離子色譜在糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用范圍，使其能夠在食品科學(xué)、生物醫(yī)藥和糖組學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。Yi等[58]利用離子交換色譜(IEC)聯(lián)用四極桿飛行時間質(zhì)譜(Q-TOF MS)對葡聚糖的分支模式進(jìn)行了深入分析。該聯(lián)用技術(shù)可同時檢測葡聚糖的分支類型及程度，為研究其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供了強(qiáng)有力的工具。Rong等[59]同樣采用了IEC-Q-TOF MS技術(shù)，研究了高原大麥中β-葡聚糖的糖苷鍵連接方式，發(fā)現(xiàn)1→3與1→4糖苷鍵的比例約為1∶3。該方法不僅有效揭示了不同大麥品種中β-葡聚糖的詳細(xì)結(jié)構(gòu)和序列，還為評估大麥品種的質(zhì)量以及β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)與應(yīng)用之間的關(guān)系提供了重要依據(jù)。此外，該技術(shù)還被用于猴頭菇子實體水溶性β-葡聚糖分支結(jié)構(gòu)的分析[60]。上述研究表明，IC-MS聯(lián)用技術(shù)在糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中具有廣泛的應(yīng)用前景，尤其在復(fù)雜多糖的聚合度分析、糖苷鍵類型鑒定及分支模式研究等方面具有顯著優(yōu)勢。張濤等[61]利用離子色譜對咖啡豆樣品進(jìn)行初步分離，并結(jié)合質(zhì)譜檢測，成功解決了不同含碳量糖類物質(zhì)之間的假陽性問題。該方法分離度優(yōu)異且準(zhǔn)確性高，為復(fù)雜樣品的糖類分析提供了可靠的解決方案。IC-MS聯(lián)用技術(shù)還廣泛應(yīng)用于嬰幼兒配方乳粉及乳制品中單糖和二糖含量測定[11]，以及蜂蜜中單糖和寡糖分布特征分析(用于鑒別不同年份及花期的蜂蜜[12])。此外，該技術(shù)還成功實現(xiàn)了10種不同聚合度的甘露糖醛酸和古羅糖醛酸的同時檢測[62]。盡管IC-MS在糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，尤其適用于缺乏結(jié)構(gòu)信息的樣品，但對于糖類物質(zhì)種類較明確的樣品，該方法可能增加額外的處理步驟和成本，因此，在選擇分析方法時，需要根據(jù)樣品的復(fù)雜度和研究目標(biāo)進(jìn)行綜合權(quán)衡。
3 結(jié)語與展望
離子色譜技術(shù)在分析簡單碳水化合物和復(fù)雜碳水化合物方面具有較高的靈敏度，因此廣泛應(yīng)用于糖類物質(zhì)的分析。除了作為常規(guī)分析方法外，近年來，該技術(shù)也逐步應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究領(lǐng)域，尤其在結(jié)合定向酶解技術(shù)解析淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)方面展現(xiàn)出顯著價值，為糖類物質(zhì)的深入研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。隨著技術(shù)的發(fā)展，離子色譜在生命科學(xué)和醫(yī)藥科學(xué)中的應(yīng)用潛力不斷增大，尤其是在糖類衍生物分析方面。憑借其廣泛的應(yīng)用范圍、較低的分析成本以及快速和靈敏的特點(diǎn)，離子色譜無疑將在糖類物質(zhì)的常規(guī)分析和基礎(chǔ)研究中繼續(xù)發(fā)揮重要作用。然而，實際應(yīng)用中仍需特別關(guān)注樣品處理條件和流動相的優(yōu)化，以確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和高效性。糖類物質(zhì)的濃度響應(yīng)系數(shù)受其分子結(jié)構(gòu)、離子色譜系統(tǒng)參數(shù)及儀器條件影響。為降低操作者的技術(shù)門檻，相關(guān)技術(shù)的優(yōu)化仍是未來發(fā)展的重點(diǎn)方向。目前，離子色譜主要適用于小分子糖類物質(zhì)的分析，對于大分子糖類物質(zhì)，需要通過酶解轉(zhuǎn)化為小分子才能進(jìn)行有效分析。由于HPAEC-PAD技術(shù)無法直接確定糖苷鍵類型，在全面解析糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)時，仍需結(jié)合其他分析技術(shù)。未來，離子色譜與凝膠色譜-多角度激光散射、核磁共振及質(zhì)譜等技術(shù)的聯(lián)用，有望在解析農(nóng)產(chǎn)品和食品中大分子糖類物質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮更大的潛力，進(jìn)一步推動糖類物質(zhì)研究的發(fā)展。
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來源：化學(xué)分析計量
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