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摘要

目的：在概述脂質(zhì)納米顆粒的基礎(chǔ)上，探討其作為RNA藥物遞送載體在新藥申報(bào)中藥學(xué)評(píng)價(jià)的關(guān)鍵考慮點(diǎn)。

方法：通過(guò)文獻(xiàn)綜述并結(jié)合藥品審評(píng)經(jīng)驗(yàn)，系統(tǒng)梳理當(dāng)前基于脂質(zhì)納米顆粒的RNA藥物的設(shè)計(jì)原理、質(zhì)量控制要點(diǎn)及評(píng)價(jià)策略。

結(jié)果與結(jié)論：RNA藥物因其廣闊的應(yīng)用前景而受到廣泛關(guān)注，但其也存在穩(wěn)定性差、靶向遞送效率低及潛在免疫原性等問(wèn)題。脂質(zhì)納米顆粒是克服這些障礙的關(guān)鍵遞送系統(tǒng)，其質(zhì)量研究與控制對(duì)于保障藥物安全有效至關(guān)重要，當(dāng)前亟需加強(qiáng)脂質(zhì)納米顆粒的質(zhì)量研究與控制。同時(shí)，考慮該類產(chǎn)品的復(fù)雜性，應(yīng)基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念和產(chǎn)品全生命周期管理的角度靈活掌握評(píng)價(jià)思路，以推動(dòng)此類創(chuàng)新藥物的研發(fā)與臨床應(yīng)用。

關(guān)鍵詞

RNA藥物；脂質(zhì)納米顆粒；質(zhì)量研究與控制；藥學(xué)評(píng)價(jià)

核糖核酸RNA（Ribonucleic Acid，RNA）由核苷酸單體聚合而成，是生命形式的重要遺傳物質(zhì)，可從基因?qū)用嬲{(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能，達(dá)到高度特異性和持久的治療效果。20世紀(jì)90年代，Andrew Fire和Craig C. Mello首次提出有關(guān)RNA干擾（RNAi）的具體概念，至今全球已有多款RNA藥物獲批臨床試驗(yàn)，2023年，Katalin Karikó和Drew Weissman因在核苷堿基修飾方面的發(fā)現(xiàn)而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，這再次助力了RNA藥物的飛速發(fā)展。然而，核酸的固有特性限制了其臨床應(yīng)用：一是藥物容易被體內(nèi)的核酸酶降解；二是缺乏靶向性以及存在脫靶效應(yīng)，這就可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，進(jìn)一步限制給藥劑量以及影響治療效果；三是自身攜帶負(fù)電荷，且分子量較高，而與同樣帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜產(chǎn)生相互排斥，導(dǎo)致分子很難通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞；四是內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞膜中的核酸，又容易被內(nèi)吞體和酸性溶酶體的微環(huán)境清除出去。這些因素共同導(dǎo)致RNA藥物難以達(dá)到靶基因而產(chǎn)生治療作用。

脂質(zhì)納米顆粒（Lipid Nanoparticles，LNPs）作為非病毒遞送系統(tǒng)，具有適宜的納米粒徑、較高的載藥量、良好的包封率和生物相容性，能夠很好克服RNA成藥性的固有缺陷，將其安全而有效地遞送至相應(yīng)靶標(biāo)，已在RNA藥物遞送方面取得了許多令人鼓舞的進(jìn)展，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。LNPs是多組分系統(tǒng)，通常由可電離脂質(zhì)、磷脂、膽固醇、聚乙二醇化脂質(zhì)等按一定比例混合而成，不同成分在LNPs中扮演著不同的角色。其中，電離脂質(zhì)是LNPs的關(guān)鍵成分，是遞送和轉(zhuǎn)染效率的決定性因素；聚乙二醇化脂質(zhì)可以平衡循環(huán)時(shí)間和細(xì)胞吸收，并影響粒徑大??；磷脂和膽固醇有益于LNPs的結(jié)構(gòu)完整性和相變行為。2018年10月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)Patisiran（商品名Onpattro）用于治療遺傳性甲狀腺素介導(dǎo)的淀粉樣變性的多發(fā)性神經(jīng)病，是全球首款基于LNPs的小干擾RNA（siRNA）藥物。

1、RNA脂質(zhì)納米顆粒在研及上市情況

近年來(lái)，LNPs在RNA藥物遞送方面已得到廣泛研究，許多RNA脂質(zhì)納米顆粒藥物（Ribonucleic Acids-Lipid Nanoparticles，RNA-LNPs）已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，且尚有不少產(chǎn)品在臨床前階段。目前，全球已獲批多款mRNA-LNPs藥物和一款siRNA-LNPs藥物。部分在研和上市的RNA-LNPs詳見表1。

2、LNPs脂質(zhì)成分的組成與質(zhì)量控制

良好的LNPs遞送系統(tǒng)應(yīng)既能促進(jìn)RNA藥物的細(xì)胞攝取又能保持較好的內(nèi)體逃逸。為了實(shí)現(xiàn)良好的平衡，目前已經(jīng)有許多不同的脂質(zhì)和類脂質(zhì)結(jié)構(gòu)被開發(fā)以滿足RNA藥物的遞送需求。20世紀(jì)80年代以來(lái)，已有大量關(guān)于通過(guò)脂質(zhì)體遞送遺傳物質(zhì)的研究，目前已開發(fā)許多可市售的脂質(zhì)輔料分子，且相關(guān)研究仍在進(jìn)行中。LNPs脂質(zhì)成分的質(zhì)量可能會(huì)對(duì)RNA-LNPs的粒徑及分布、電荷、包封率、制備及純化工藝、免疫原性及活性產(chǎn)生重要的影響，需對(duì)其進(jìn)行充分的篩選和質(zhì)量控制。

2.1 可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)

早期開發(fā)的LNPs主要是利用中性脂類的被動(dòng)式包封法，該法包封效率較低、轉(zhuǎn)染效力有限、熱力學(xué)不穩(wěn)定、溶血以及免疫原性等缺點(diǎn)限制了其臨床應(yīng)用。隨后開發(fā)的陽(yáng)離子脂質(zhì)由于帶正電荷，能夠與帶負(fù)電荷的RNA藥物通過(guò)靜電吸附作用相結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)自組裝。然而，陽(yáng)離子脂質(zhì)相比可電離脂質(zhì)（電荷取決于周圍環(huán)境的pH值）功效較差且毒性更大。為了克服陽(yáng)離子脂質(zhì)的缺點(diǎn)，研究人員開發(fā)了多種可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)（Ionizable Lipids，ILs），在環(huán)境pH值低于可電離脂質(zhì)pKa值時(shí)，氨基質(zhì)子化與帶負(fù)電的核酸分子結(jié)合自組裝并包裹RNA藥物形成納米顆粒，而在生理pH值下則形成表面幾乎呈電中性的LNPs，而使毒性大大降低。這些脂質(zhì)包括胺頭基團(tuán)、連接基團(tuán)和疏水尾部3個(gè)部分，詳見圖1。通過(guò)改變這3個(gè)部分以獲得適中pKa值和轉(zhuǎn)變溫度的脂質(zhì)，使藥物在循環(huán)過(guò)程中保持中性和穩(wěn)定性，而在細(xì)胞攝取后實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物遞送的安全性和有效性。

鑒于可電離脂質(zhì)的重要作用，對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制是必要的。對(duì)新分子可電離脂質(zhì)一般可參照原料藥相關(guān)要求的思路進(jìn)行研究與控制?？呻婋x脂質(zhì)除應(yīng)符合注射用輔料的一般要求外（例如含量、脂質(zhì)雜質(zhì)、微生物限度、細(xì)菌內(nèi)毒素等），需重點(diǎn)關(guān)注其功能性。研究顯示，增加可電離脂質(zhì)疏水尾部的不飽和度將顯著提高制劑活性，因此建議關(guān)注不飽和度，以及可能的脂質(zhì)氧化雜質(zhì)等；合適的pKa值對(duì)可電離脂質(zhì)發(fā)揮目標(biāo)功能至關(guān)重要，因此應(yīng)加強(qiáng)pKa值等相關(guān)質(zhì)量屬性的研究與控制，同時(shí)加強(qiáng)可電離脂質(zhì)潛在的水解雜質(zhì)和不同疏水尾部鏈長(zhǎng)雜質(zhì)的控制；應(yīng)結(jié)合制備工藝，關(guān)注可能引入的其他潛在雜質(zhì)。對(duì)于新型脂質(zhì)，還需提供安全性依據(jù)。同時(shí)，應(yīng)注意持續(xù)累積不同來(lái)源、同一來(lái)源不同批次間脂質(zhì)可能的潛在差異數(shù)據(jù)，關(guān)注其對(duì)制劑質(zhì)量的潛在影響，采取相應(yīng)的控制措施。

2.2 聚乙二醇化脂質(zhì)、磷脂、膽固醇

聚乙二醇化脂質(zhì)是另一種重要的LNPs成分，包括親水性聚乙二醇聚合物與疏水性脂質(zhì)2個(gè)部分，位于脂質(zhì)顆粒的表面，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域埋入顆粒中，而聚乙二醇結(jié)構(gòu)域從表面延伸出來(lái)。良好的聚乙二醇化脂質(zhì)可以平衡血液循環(huán)時(shí)間和細(xì)胞吸收，減少顆粒聚集和被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，能夠穩(wěn)定脂質(zhì)顆粒。應(yīng)關(guān)注相對(duì)分子質(zhì)量及分布系數(shù)等，同樣應(yīng)結(jié)合其制備工藝，關(guān)注可能引入的雜質(zhì)。

磷脂和膽固醇在LNPs的結(jié)構(gòu)完整性和相變行為方面發(fā)揮重要作用，影響RNA的包封和穩(wěn)定性。此外，磷脂的存在有助于通過(guò)切向流超濾進(jìn)行制劑處理。聚乙二醇化脂質(zhì)、磷脂和膽固醇可參照有關(guān)脂質(zhì)體藥物中相關(guān)輔料的控制思路進(jìn)行研究與控制。

綜上所述，應(yīng)根據(jù)脂質(zhì)成分的類型、特征或來(lái)源提供相應(yīng)的信息，并進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制研究。應(yīng)加強(qiáng)脂質(zhì)來(lái)源的供應(yīng)商審計(jì)，結(jié)合國(guó)內(nèi)外藥典標(biāo)準(zhǔn)和供應(yīng)商標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)對(duì)動(dòng)物源性（包括人源性）材料應(yīng)提供潛在外源因子風(fēng)險(xiǎn)控制和病毒去除和/或滅活的研究及驗(yàn)證資料。對(duì)于新型輔料或超出常規(guī)用法用量的輔料，需提供充分完整的研究資料以支持其使用。

3、RNA-LNPs的制備及過(guò)程控制

RNA-LNPs的制備依賴于自組裝能力，帶負(fù)電荷的RNA和可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)之間通過(guò)靜電相互作用結(jié)合，再通過(guò)脂質(zhì)組分間的疏水作用和范德華力進(jìn)行組裝，進(jìn)而形成RNA-LNPs復(fù)合物。自組裝過(guò)程是制劑生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵步驟，涉及脂質(zhì)制備或篩選、RNA包封/裝載、純化等工序。

目前，乙醇稀釋法是一種比較常用的制備RNA-LNPs的方法。乙醇稀釋法是使用T形管混合器在特定條件（如溫度、流速）下將脂質(zhì)油相、核酸水相、稀釋相混合產(chǎn)生RNA-LNPs。文獻(xiàn)顯示，該技術(shù)用于Onpattro的生產(chǎn)，并已用于其他幾個(gè)臨床階段的LNPs產(chǎn)品。采用微流控混合技術(shù)制備LNPs同樣是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，微流控混合技術(shù)是將核酸與脂質(zhì)分別溶解在水相和有機(jī)相后，將兩相溶液注入制備系統(tǒng)的兩條入口通道，一端是RNA的水溶液，一端是脂質(zhì)的乙醇溶液，通過(guò)兩相的快速混合，完成核酸脂質(zhì)納米顆粒的合成，詳見圖2。該技術(shù)可以在納米或微米級(jí)別的通道中操控微量流體，通過(guò)改變芯片形狀、流體流速、流量、混合順序等因素精密控制層流液體混合效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)LNPs粒徑均一、質(zhì)量可控的目的。

研究表明，相同脂質(zhì)材料仍存在不同產(chǎn)品或不同批次mRNA-LNPs形態(tài)具有差異的情況，說(shuō)明關(guān)鍵工藝參數(shù)及LNPs制備設(shè)備等對(duì)mRNA-LNPs關(guān)鍵質(zhì)量屬性影響較大，因此在工藝開發(fā)及優(yōu)化過(guò)程中開展更多表征研究對(duì)于工藝和產(chǎn)品質(zhì)量的不斷優(yōu)化尤為重要。

一般來(lái)說(shuō)，新藥研發(fā)過(guò)程中，伴隨著臨床試驗(yàn)進(jìn)展，藥學(xué)研究與控制一般呈現(xiàn)逐步遞進(jìn)的特點(diǎn)。例如在申報(bào)臨床時(shí)，更多的是關(guān)注藥品安全性，而在藥學(xué)研究與控制方面允許在臨床試驗(yàn)過(guò)程中逐步修訂完善。但是對(duì)于特殊制劑，由于臨床試驗(yàn)期間的變更對(duì)藥品質(zhì)量影響一般更大，僅通過(guò)體外質(zhì)量對(duì)比通常不足以反映變更前后的藥品質(zhì)量，有時(shí)需要開展體內(nèi)橋接研究，這時(shí)藥學(xué)研究與控制工作可能需要盡量前移以減少體內(nèi)橋接的風(fēng)險(xiǎn)。RNA-LNPs藥物為特殊的復(fù)雜制劑，新藥開發(fā)過(guò)程中，需盡早注意參照相關(guān)指導(dǎo)原則開展處方及工藝研究，通過(guò)對(duì)處方中原輔料、生產(chǎn)工藝與制劑關(guān)鍵質(zhì)量屬性（如粒徑及粒徑分布、微觀形態(tài)/結(jié)構(gòu)、包封率、釋放度、空載LNPs比例、表面電荷、顆粒數(shù)及顆粒濃度、不同粒子中脂質(zhì)成分均勻性等）的研究，合理確定處方工藝，關(guān)注關(guān)鍵質(zhì)量屬性與處方工藝的相關(guān)性，明確關(guān)鍵工藝步驟（如納米粒形成等）和工藝參數(shù)，建立有效的過(guò)程控制措施。應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品特性，建立合理的中間產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)注中間產(chǎn)品暫存穩(wěn)定性，持續(xù)累積中間產(chǎn)品質(zhì)量數(shù)據(jù)。建議臨床試驗(yàn)期間進(jìn)一步累積制劑生產(chǎn)過(guò)程中LNPs包封、濃縮超濾、稀釋混合、除菌過(guò)濾、灌裝等各階段的粒徑及分布數(shù)據(jù)，確保產(chǎn)品批間一致性。鼓勵(lì)采用光鏡/電鏡等技術(shù)對(duì)形成納米顆粒及以后各工藝步驟的粒子形態(tài)進(jìn)行考察，采用現(xiàn)行科學(xué)技術(shù)對(duì)納米顆粒的機(jī)理和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。關(guān)注臨床研究進(jìn)程中生產(chǎn)場(chǎng)地、工藝、設(shè)備和批量等變化對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響，累積充足的研究數(shù)據(jù)，關(guān)鍵臨床批樣品的處方及工藝應(yīng)盡量與擬商業(yè)化批保持一致。同時(shí)需參照國(guó)內(nèi)外滅菌/無(wú)菌工藝相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則開展相關(guān)研究，對(duì)于采用除菌過(guò)濾工藝的，注意考察擬定過(guò)濾條件下是否存在納米顆粒截留。對(duì)于前期批量較小的生產(chǎn)工藝，應(yīng)關(guān)注擬定商業(yè)化批量的可行性與可控性，同時(shí)詳細(xì)記錄臨床樣品的制備過(guò)程，關(guān)注臨床研究進(jìn)程中生產(chǎn)場(chǎng)地、工藝、設(shè)備和批量等的變化對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量可能的影響，必要時(shí)開展體內(nèi)橋接研究。另外，產(chǎn)品開發(fā)過(guò)程中仍需關(guān)注新型輔料的安全性（如脂質(zhì)輔料本身及其引入的雜質(zhì)等）與控制、制劑過(guò)程的工藝參數(shù)及控制、生產(chǎn)貯存和使用中的穩(wěn)定性、生產(chǎn)組件（含濾芯）及包材相容性、包裝密封性、配伍穩(wěn)定性（如涉及）以及可能出現(xiàn)的分層現(xiàn)象等。需要注意的是，申請(qǐng)人應(yīng)充分利用溝通交流通道，在各關(guān)鍵研發(fā)階段提出具體的溝通交流問(wèn)題以輔助藥品開發(fā)。

4、RNA-LNPs藥物質(zhì)量研究與控制

對(duì)多個(gè)批次RNA-LNPs藥物（包括中間產(chǎn)品）進(jìn)行詳細(xì)的質(zhì)量研究及理化性質(zhì)表征，一方面可以評(píng)估處方組成和生產(chǎn)工藝對(duì)RNA-LNPs藥物質(zhì)量的影響，優(yōu)化和確定工藝參數(shù)；另一方面，可以確定影響RNA-LNPs藥物體內(nèi)外行為的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供合理依據(jù)，保證預(yù)期的藥品質(zhì)量。

ICH Q6A指南指出質(zhì)量控制體系包括質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所依據(jù)的開發(fā)期間獲得的全部產(chǎn)品性質(zhì)和藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（Good Manufacturing Practice，GMP）的執(zhí)行情況，如合適的設(shè)施、已驗(yàn)證的生產(chǎn)工藝、已驗(yàn)證的檢測(cè)方法、原材料的檢驗(yàn)、生產(chǎn)過(guò)程中的檢驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)等。脂質(zhì)體藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則指出脂質(zhì)體藥物質(zhì)量控制的整體思路是基于藥物評(píng)價(jià)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估策略和從研發(fā)、生產(chǎn)到使用的全過(guò)程質(zhì)量控制策略。需對(duì)脂質(zhì)體藥物及其中間產(chǎn)品的表征方法進(jìn)行篩選、優(yōu)化和驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上，對(duì)脂質(zhì)體藥物的質(zhì)量屬性進(jìn)行重點(diǎn)研究，鼓勵(lì)建立處方組成、工藝參數(shù)、中間產(chǎn)品質(zhì)量控制等與脂質(zhì)體藥物質(zhì)量屬性之間的相關(guān)性。因此，需參考ICH Q6A和相關(guān)指南的控制理念對(duì)RNA-LNPs的質(zhì)量控制進(jìn)行全面考慮。

RNA-LNPs藥物的研究、控制項(xiàng)目除普通注射劑的常規(guī)要求外，一般還包括粒徑及粒徑分布、微觀形態(tài)/結(jié)構(gòu)（如電鏡形態(tài)、冷凍電鏡、負(fù)染電鏡等）、表面電荷、乙醇（溶解脂質(zhì)用）、脂質(zhì)含量、脂質(zhì)雜質(zhì)、包封率及釋放度等。Onpattro的FDA審評(píng)報(bào)告中的質(zhì)控項(xiàng)目包括鑒別、含量、純度、脂質(zhì)成分的含量與鑒別、溶劑殘留、包封率、粒度、體外釋放、無(wú)菌、細(xì)菌內(nèi)毒素及不溶性微粒等；SPIKEVAX™的FDA審評(píng)報(bào)告中的質(zhì)控項(xiàng)目包括性狀、鑒別、有關(guān)物質(zhì)、脂質(zhì)含量、脂質(zhì)雜質(zhì)、pH、粒度、細(xì)菌內(nèi)毒素及無(wú)菌等。需注意開發(fā)適當(dāng)經(jīng)驗(yàn)證的包封率測(cè)定方法（如超速離心、超濾、凝膠色譜等）和釋放度方法，確保方法的穩(wěn)健性與可靠性，必要時(shí)可采用不同原理的方法對(duì)包封率測(cè)定方法進(jìn)行交叉驗(yàn)證。

5、穩(wěn)定性

穩(wěn)定性研究過(guò)程中需盡可能累積多批次樣品（含關(guān)鍵臨床批）全面的研究數(shù)據(jù)（除注射劑常規(guī)檢查項(xiàng)目外，建議還應(yīng)包括未訂入標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目，如表征項(xiàng)目、釋放曲線、微觀形態(tài)/結(jié)構(gòu)等），以便于充分了解產(chǎn)品貯存過(guò)程中的質(zhì)量變化情況。研究表明，各脂質(zhì)成分比例和載藥量的細(xì)微差異都可能會(huì)影響LNPs的物理化學(xué)屬性，如顆粒大小、形態(tài)、封裝效率和表面電荷，進(jìn)而導(dǎo)致不同的安全性，應(yīng)監(jiān)測(cè)脂質(zhì)摩爾比或脂質(zhì)與RNA比例（如氮磷比）的變化情況，這也是確定產(chǎn)品一致性和穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。另外，同普通注射劑一樣還需采用經(jīng)驗(yàn)證的方法關(guān)注效期末樣品的包材遷移研究和必要的配伍穩(wěn)定性研究。

6、結(jié)語(yǔ)

首款siRNA-LNPs藥物Onpattro的獲批和多款mRNA-LNPs疫苗的上市進(jìn)一步促進(jìn)了RNA-LNPs藥物的發(fā)展。但RNA-LNPs藥物仍然存在不少問(wèn)題和挑戰(zhàn)，如靶向肝外組織、缺乏新型脂質(zhì)輔料和成熟的工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備、新技術(shù)對(duì)監(jiān)管的挑戰(zhàn)等。本文簡(jiǎn)述了RNA-LNPs藥物的基本原理和控制思路，但考慮該類產(chǎn)品的復(fù)雜性，應(yīng)基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念和產(chǎn)品全生命周期管理的角度靈活掌握評(píng)價(jià)思路。相信隨著新技術(shù)、新理念、新方法的不斷創(chuàng)新與發(fā)展，RNA-LNPs藥物未來(lái)將更好地服務(wù)于人民群眾。