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摘 要： 綜述了激光誘導(dǎo)擊穿光譜（LIBS）成像技術(shù)的基礎(chǔ)原理以及在生物和醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的技術(shù)發(fā)展，對(duì)比了不同數(shù)據(jù)處理方式的特點(diǎn)及應(yīng)用場(chǎng)景。在植物樣品元素成像領(lǐng)域，LIBS成像技術(shù)可用于研究金屬在植物各個(gè)組織或器官的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，為研究生物代謝過(guò)程與毒理學(xué)提供技術(shù)支撐；在動(dòng)物樣品元素成像領(lǐng)域，LIBS成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)空間分辨率為亞微米級(jí)別的金屬納米顆粒原位檢測(cè)，并可結(jié)合多元素的3D分布結(jié)果用于研究生物病理學(xué)規(guī)律；在人體相關(guān)的醫(yī)學(xué)研究中，LIBS成像技術(shù)可以用于個(gè)人生物信息識(shí)別以及改進(jìn)臨床診斷、識(shí)別癌癥細(xì)胞等方面。提出了LIBS在元素成像、原位檢測(cè)等應(yīng)用領(lǐng)域中所面臨的問(wèn)題和挑戰(zhàn)，以期通過(guò)改進(jìn)數(shù)據(jù)處理方式、開(kāi)發(fā)原位微區(qū)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)樣品定量/半定量分析、與人工智能相結(jié)合等方式，使得LIBS在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有更廣泛的應(yīng)用前景。

 

關(guān)鍵詞： 激光誘導(dǎo)擊穿光譜儀（LIBS）； 元素成像； 生物醫(yī)學(xué)； 定量分析； 應(yīng)用進(jìn)展

 

近年來(lái)，隨著激光誘導(dǎo)擊穿光譜(LIBS)技術(shù)的發(fā)展，其檢測(cè)性能得到顯著提升，已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、地質(zhì)、材料分析等多個(gè)領(lǐng)域的微觀元素成像研究[1]。LIBS通過(guò)超短脈沖激光聚焦樣品表面，激發(fā)該區(qū)域原子或離子形成離子體，然后對(duì)等離子體發(fā)射光譜進(jìn)行分析可獲得樣品中元素的成分及含量[2]。該方法可以從單個(gè)激光脈沖中完成元素測(cè)量，脈沖通過(guò)激光燒蝕采樣的同時(shí)，還可以通過(guò)加熱等離子體使燒蝕的蒸氣原子化并激發(fā)?；诖颂匦裕琇IBS成像技術(shù)具有儀器簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快(高達(dá)kHz)、兼容常規(guī)光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)等優(yōu)點(diǎn)，并可與其他技術(shù)(如拉曼光譜等)進(jìn)行聯(lián)用[3]。LIBS成像還具有多元素同時(shí)檢測(cè)、可測(cè)量輕質(zhì)量元素、元素檢出限低(多數(shù)元素達(dá)μg/g量級(jí))、空間分辨率高(微米級(jí))等優(yōu)點(diǎn)。作為一種兼具元素高靈敏度和空間分辨力的檢測(cè)方法，LIBS成像可以與激光剝蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜(LA-ICP-MS)、同步輻射微區(qū)X射線熒光(μXRF)、電子探針(EPMA)等分析方法形成互補(bǔ)，開(kāi)展聯(lián)合檢測(cè)的應(yīng)用研究[4]。

 

關(guān)于LIBS相關(guān)技術(shù)的報(bào)道始于20世紀(jì)60年代初期，當(dāng)時(shí)對(duì)LIBS的研究主要集中在微量元素定量分析領(lǐng)域[5]。隨著性能更強(qiáng)的激光器及矩陣探測(cè)器的出現(xiàn)，該技術(shù)大量應(yīng)用于樣品微觀尺度分析中，如陶瓷樣品中鈰的分布、以kHz的工作速率研究鋼材中多種雜質(zhì)元素分布、大尺度樣品表面分析及元素的三維成像分析等[6]。之后隨著增強(qiáng)電荷耦合探測(cè)器(ICCD)的面世，LIBS元素成像技術(shù)的檢測(cè)速度更快、靈敏度更高。由于生物醫(yī)學(xué)樣品具有采樣量少且難以獲取重復(fù)樣品、基體復(fù)雜、干擾因素多、待測(cè)元素濃度波動(dòng)范圍大、樣品制備過(guò)程復(fù)雜等特性，相較于其他成像設(shè)備，高速、高靈敏度、高分辨率的LIBS元素成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)組織成像領(lǐng)域開(kāi)拓了新的應(yīng)用方向。伴隨著超高分辨率(百萬(wàn)級(jí)像素)圖像的技術(shù)突破，LIBS元素成像已成為在生物醫(yī)學(xué)前沿研究中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一[7]。近年來(lái)，LIBS儀器開(kāi)發(fā)研究主要集中于光譜采集的后期數(shù)據(jù)處理技術(shù)。由于LIBS成像在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用需要處理大量數(shù)據(jù)，而該類(lèi)樣品中主要化合物、次要化合物和痕量元素的光譜數(shù)量存在顯著差異及干擾，所以?xún)?yōu)化數(shù)據(jù)處理方法(如化學(xué)計(jì)量學(xué)的應(yīng)用)將成為L(zhǎng)IBS技術(shù)未來(lái)的發(fā)展方向與挑戰(zhàn)。筆者主要概述了LIBS成像技術(shù)在生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的最新進(jìn)展與應(yīng)用研究，同時(shí)對(duì)LIBS成像數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了簡(jiǎn)要探討。

 

1 LIBS成像技術(shù)簡(jiǎn)介

1.1 LIBS成像原理

LIBS成像的原理是將高能量脈沖激光聚焦在目標(biāo)區(qū)域樣品上，以燒蝕少量樣品表面(樣品量通常為微克或更少)并激發(fā)燒蝕的樣品產(chǎn)生一系列等離子體，激光誘導(dǎo)產(chǎn)生的等離子體壽命約幾微秒，溫度為10 000 K左右，該類(lèi)方式可以激發(fā)絕大多數(shù)元素。然后，不同元素通過(guò)發(fā)射自身獨(dú)有光譜特征譜線返回基態(tài)，包含特征元素的等離子體發(fā)射的光被不同的光學(xué)元件(如透鏡、聚焦鏡或光纖等)收集，隨后采用光譜儀對(duì)不同光譜的波長(zhǎng)和強(qiáng)度進(jìn)行分析處理[8]，識(shí)別檢測(cè)到特定元素的特征發(fā)射譜線，從而構(gòu)建相應(yīng)的元素分布圖像[9]。在發(fā)射光譜上觀察到的譜線(原子、離子或分子)的強(qiáng)度與樣品的元素組成直接相關(guān)。在樣品測(cè)定過(guò)程中，樣品通常放置在可編程的電動(dòng)XY載物臺(tái)上，載物臺(tái)移動(dòng)的步長(zhǎng)(即連續(xù)激光照射之間的距離)決定了元素圖像最終的分辨率[10]。通常，最小分辨率由激光剝蝕坑大小決定，一般情況下不會(huì)在連續(xù)的激光照射之間獲取樣品重疊區(qū)域的譜線，因?yàn)樵摬僮鲿?huì)導(dǎo)致測(cè)量重復(fù)性降低[11]。在大多數(shù)情況下，光譜儀更容易收集固定位置等離子體發(fā)射的光，因此LIBS成像儀器大多采用樣品移動(dòng)的方式，而不是用可移動(dòng)的激光束進(jìn)行掃描[12]。然而，對(duì)于需要對(duì)大型樣品表面進(jìn)行高頻率掃描的特定應(yīng)用場(chǎng)景(如樣品的在線控制)，也可以同時(shí)使激光束與光譜采集系統(tǒng)連續(xù)移動(dòng)[13]。

1.2 LIBS成像儀器配置

LIBS成像的儀器配置受多個(gè)因素的影響，主要包括激光聚焦系統(tǒng)、激光源、檢測(cè)系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理等因素[14]。激光聚焦系統(tǒng)決定了LIBS成像結(jié)果最終的分辨率，焦距越短，工作距離越小，剝蝕尺寸越小，分辨率越高；在剝蝕區(qū)域通入流動(dòng)的氬氣，可提高該剝蝕區(qū)域內(nèi)等離子體的隔熱性和準(zhǔn)直性[15]。為提升LIBS成像檢測(cè)質(zhì)量，通常可以通過(guò)拋光實(shí)現(xiàn)樣品表面的干凈與平整，以保證整個(gè)成像過(guò)程中光學(xué)系統(tǒng)焦平面的定位[16]。LIBS激光源的輸出能量、脈沖時(shí)間及激發(fā)方向等方面的穩(wěn)定性直接影響作用于樣品上剝蝕等離子體及檢測(cè)信號(hào)收集產(chǎn)生的波動(dòng)效應(yīng)，在LIBS成像檢測(cè)均勻樣品的微量分析中，激光的單點(diǎn)發(fā)射穩(wěn)定性更為關(guān)鍵[17]。LIBS檢測(cè)系統(tǒng)包括光譜儀和探測(cè)器，需綜合考慮光譜分辨率、光譜測(cè)量范圍(多元素檢測(cè)能力)、光譜儀亮度(測(cè)量靈敏度)、運(yùn)行速度及成本等參數(shù)的影響[18]；當(dāng)激光發(fā)射頻率超過(guò)一定閾值(通常大于200 Hz)時(shí)，傳統(tǒng)耦合矩陣探測(cè)器的響應(yīng)速度可能無(wú)法匹配激光發(fā)射頻率，因此需要采用響應(yīng)速度更快的傳感器(如更快感光材料)，以提高檢測(cè)靈敏度[19]。LIBS成像的數(shù)據(jù)處理主要是提取光譜數(shù)據(jù)，并將其轉(zhuǎn)化為具有特定元素空間分布的圖像形式[20]，其中需要考慮樣品基質(zhì)效應(yīng)、光譜干擾、譜線自吸收現(xiàn)象等的影響[21]。

 

2 LIBS成像技術(shù)應(yīng)用

LIBS成像具有微米級(jí)分辨率、檢出限低至μg/g量級(jí)、檢測(cè)速度快(高達(dá)kHz)等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其在應(yīng)用研究中可與其他光譜成像技術(shù)(如LA-ICP-MS、微區(qū)XRF等)形成互補(bǔ)。近年來(lái)，LIBS成像在生物或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有更為廣泛的應(yīng)用，例如在植物、動(dòng)物、人體組織樣品中的內(nèi)源性化學(xué)元素直接成像方面，為研究生物器官的病理生理狀態(tài)提供了更全面的技術(shù)支撐。生物醫(yī)學(xué)樣本通常在細(xì)胞含量方面具有高度異質(zhì)性，同時(shí)不同生物體(例如植物、動(dòng)物、人體)組織中的細(xì)胞與病理生理細(xì)胞化學(xué)成分也存在多樣性，而LIBS的元素成像可在樣本沒(méi)有預(yù)處理的前提下，為臨床研究人員收集樣品表面完整的光譜化學(xué)信息，例如在微米級(jí)的給定組織區(qū)域中，LIBS成像可以通過(guò)肌肉細(xì)胞周?chē)纳掀ぜ?xì)胞以及含有血細(xì)胞的鄰近血管確定骨組織。在生物醫(yī)學(xué)中，除了血液或其他體液的分析，生物組織元素LIBS成像技術(shù)比其他微量分析技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)[22]。

2.1 LIBS成像技術(shù)在植物組織中的應(yīng)用

LIBS成像技術(shù)可針對(duì)植物不同的部位(如根、莖、花或果實(shí))進(jìn)行掃描，獲得的元素分布信息有助于了解植物潛在的營(yíng)養(yǎng)(鈉、鉀、磷等)失調(diào)過(guò)程，營(yíng)養(yǎng)失調(diào)過(guò)程的研究可應(yīng)用于植物的健康、疾病、營(yíng)養(yǎng)攝入不足，或受到污染的大氣、水、土壤的溯源工作中[23]。為了研究植物根際養(yǎng)分交換的空間控制，LIBS元素成像可用于對(duì)根際土壤系統(tǒng)中有機(jī)物含量和無(wú)機(jī)成分成像研究，該研究實(shí)現(xiàn)了在長(zhǎng)度約1 mm的柳枝草根小樣本上，獲得了分辨率約為100 μm的17種常量營(yíng)養(yǎng)元素、微量營(yíng)養(yǎng)元素和基質(zhì)元素的分布圖像及精細(xì)的化學(xué)梯度分布規(guī)律。該研究表明，LIBS成像技術(shù)適合作為一種有效的空間分辨技術(shù)用于微小樣品，如復(fù)雜土壤基質(zhì)和植物根際的快速、高靈敏度多元素同時(shí)采集分布研究[24]。LIBS元素生物成像也可用于測(cè)量富硒對(duì)可食用蘑菇中可擴(kuò)散內(nèi)源性陽(yáng)離子分布的影響，研究發(fā)現(xiàn)，富硒改變了鉀和鎂的分布，增加了蘑菇下部鈣的生物累積，由此可以推斷，硒改變了鈣、鉀和鎂的運(yùn)輸和區(qū)室化過(guò)程，從而影響其生物代謝過(guò)程[25]。LIBS成像還可用于分析輕質(zhì)元素，例如分析斑點(diǎn)羅漢果葉片中鋰的分布[26]；采用雙脈沖方式還可用于研究水稻葉片中鉻的分布規(guī)律[27]。LIBS成像技術(shù)可用來(lái)輔助檢測(cè)白芥作物(Sinapis alba L.)中鎘的分布，通過(guò)將LIBS成像與微區(qū)LIBS相結(jié)合，分別實(shí)現(xiàn)了100 μm和25 μm的橫向分辨率，由此檢測(cè)到暴露于氯化鎘溶液或碲化鎘量子點(diǎn)的植物根部中鎘的不同空間分布規(guī)律[28]。使用納米粒子增強(qiáng)激光誘導(dǎo)擊穿光譜(NELIBS)，可顯著提高檢測(cè)植物中有害化學(xué)物質(zhì)的靈敏度，通過(guò)空間分辨的方式分析鎘等有毒物質(zhì)在生菜葉片和莖中的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重金屬在可食用植物葉片中分布不均勻，葉脈中的濃度高于葉肉。該研究表明相比于傳統(tǒng)LIBS技術(shù)，NELIBS的靈敏度可提高2個(gè)數(shù)量級(jí)[29]。

2.2 LIBS成像技術(shù)在動(dòng)物組織中的應(yīng)用

儀器分析技術(shù)的選擇對(duì)于生物組織中金屬納米化合物的成像至關(guān)重要[30]，檢測(cè)生物組織元素成像技術(shù)主要包含粒子激發(fā)X射線熒光分析(PIXE)、X射線熒光顯微技術(shù)(XFM)、二次離子質(zhì)譜(SIMS)和LA-ICP-MS等，幾乎所有的元素成像技術(shù)都被用于直接檢測(cè)腦組織內(nèi)的可擴(kuò)散離子(如Na+、Mg2+、Ca2+、K+和Cl-等)[31]。而微區(qū)LIBS成像針對(duì)納米醫(yī)學(xué)和神經(jīng)學(xué)有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如在腦元素成像領(lǐng)域中可使用LIBS實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性化學(xué)元素(如P、Mg、Ca、Na、Cu和Fe)的可視化[32]。LIBS成像技術(shù)是研究整體器官尺度上重金屬穩(wěn)態(tài)時(shí)空調(diào)節(jié)的最可靠工具，例如利用LIBS對(duì)大腦中的Zn、Ca、Mg、Na、Cu和P等分布進(jìn)行成像和定量分析。LIBS成像技術(shù)結(jié)合3D成像模型有助于研究胚胎發(fā)育過(guò)程，可用于研究大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育和成熟過(guò)程中Zn的分布和時(shí)間調(diào)控規(guī)律[33]。LIBS成像技術(shù)同樣適合對(duì)動(dòng)物器官中金屬納米顆粒(NP)進(jìn)行檢測(cè)，用以研究治療劑的藥物代謝動(dòng)力學(xué)或生物組織中內(nèi)源性元素的病理生理過(guò)程。LIBS與X射線熒光相結(jié)合，用于納米簇的超小發(fā)光金(Au)顆粒在動(dòng)物的器官和皮下移植腫瘤中的分布研究，通過(guò)LIBS成像可發(fā)現(xiàn)腎臟中Au NP的高積累，而在肝臟和脾臟中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到Au NP，該結(jié)果可用于評(píng)估金屬NP在生物體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)過(guò)程，表明該創(chuàng)新化合物在非?？斓臅r(shí)間尺度上優(yōu)先通過(guò)尿液排出。該研究表明LIBS成像可在動(dòng)物組織尺度與亞細(xì)胞尺度的元素成像積累分布規(guī)律研究中發(fā)揮重要作用[34]。金屬NP生物成像方面最顯著的進(jìn)步之一是利用雙脈沖LIBS技術(shù)研究銦NP在細(xì)胞內(nèi)的分布，該研究使LIBS成像技術(shù)在生物研究中首次超越微米級(jí)分辨率，其納米激光探針可將橫向分辨率提高到500 nm；采用飛秒激光(采樣515 nm)與納秒激光(發(fā)射266 nm)的組合實(shí)現(xiàn)了金屬NP在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的可視化，研究發(fā)現(xiàn)銦元素圖像與細(xì)胞中溶酶體的熒光圖像精確對(duì)應(yīng)，表明NP在被溶酶體捕獲之前通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。采用雙脈沖LIBS檢測(cè)技術(shù)不僅首次獲得了金屬NP在細(xì)胞器中亞細(xì)胞分布的高分辨像，而且其絕對(duì)檢出量降低至18.3 fg，為有關(guān)金屬NP和細(xì)胞之間行為和相互作用機(jī)理研究提供了有效技術(shù)支撐[35]。將LIBS成像應(yīng)用于患有原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的老鼠大腦中，對(duì)其中鑭(La)、鈰(Ce) NP進(jìn)行成像研究，發(fā)現(xiàn)在腫瘤部位同時(shí)存在La和Ce，證明藥物對(duì)放射治療有積極反應(yīng)。該研究實(shí)現(xiàn)了金屬NP原位檢測(cè)的高穩(wěn)定性，表明LIBS成像可間接反映抗癌治療的療效[36]。LIBS成像技術(shù)還具有可以檢測(cè)輕元素的優(yōu)勢(shì)，在一項(xiàng)基于中子捕獲的創(chuàng)新放射治療研究中，為匹配放射治療的發(fā)展需求，采用LIBS成像成功確定了攜帶腫瘤的雞胚模型中含硼熒光團(tuán)的分布。這類(lèi)針對(duì)輕元素硼的成像研究，彰顯了LIBS在生物領(lǐng)域應(yīng)用的巨大潛力[37]。LIBS還可以通過(guò)使用等離子體的分子發(fā)射間接分析元素分布，例如在針對(duì)鯊魚(yú)牙齒的研究中，通過(guò)CaF分子的光譜發(fā)射線進(jìn)行了氟成像[38]。分子發(fā)射在LIBS中的應(yīng)用研究也是一個(gè)不斷發(fā)展的新領(lǐng)域，可為單獨(dú)分析某一元素成像提供輔助支撐[39]。例如，在移植黑色素瘤細(xì)胞的小鼠皮下組織中，采用LIBS成像原位檢測(cè)腫瘤部位的K元素發(fā)射信號(hào)和碳氮分子(CN)發(fā)射信號(hào)，獲得的高分辨率元素分布信息成功實(shí)現(xiàn)了黑色素瘤和周?chē)菒盒哉嫫ぶg的區(qū)分[40]。法國(guó)研究小組率先開(kāi)發(fā)和改進(jìn)了LIBS技術(shù)用于對(duì)動(dòng)物組織的元素含量的生物成像研究[8]，使用基于紫外線的LIBS成像以多元素和定量方式研究釓硅基納米顆粒分布規(guī)律，在靜脈注射后對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)收集的小鼠環(huán)氧樹(shù)脂包埋腎臟進(jìn)行了元素分析，實(shí)現(xiàn)了40 μm的圖像分辨率的分布結(jié)果[41]。隨后切換到紅外激光源，在腎臟和整個(gè)器官尺度上對(duì)相同的小型治療納米化合物進(jìn)行3D成像，在3個(gè)維度上獲得了約10 μm的高分辨率元素分布圖像[42]。之后該研究小組在人類(lèi)標(biāo)本上實(shí)現(xiàn)了LIBS成像研究，獲得軟基質(zhì)2D-LIBS多元素分析結(jié)果，即人類(lèi)石蠟包埋皮膚活檢、生成正常皮膚和一系列皮膚癌中內(nèi)源性多元素分布圖[43]。

2.3 LIBS成像技術(shù)在人體組織中的應(yīng)用

隨著LIBS成像設(shè)備的快速發(fā)展和低成本化，其在指紋識(shí)別中發(fā)揮重要的作用。LIBS成像技術(shù)可以根據(jù)每個(gè)指紋的特定化學(xué)成分而消除多個(gè)重疊指紋的干擾，這一突破可能在需要分析指紋的犯罪調(diào)查中得到廣泛應(yīng)用[44]。通常采用單點(diǎn)LIBS和主成分分析(PCA)很難區(qū)分兩個(gè)不同人的指紋，而結(jié)合LIBS成像技術(shù)利用125 μm的橫向分辨率，通過(guò)軟件建模分析，可以實(shí)現(xiàn)重疊情況下對(duì)每個(gè)指紋進(jìn)行重建[45]。通過(guò)分析人類(lèi)肉芽腫、淋巴結(jié)或疤痕標(biāo)本或體液等異常組織病理學(xué)特征的元素含量，人們首次實(shí)現(xiàn)了LIBS成像在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，LIBS成像可用于研究外源性可溶性化合物(如Al化合物、Ti或W的金屬顆粒、Cu等元素)在人體組織中的分布[46]。LIBS成像技術(shù)在人類(lèi)病理學(xué)中應(yīng)用最廣泛的是在改進(jìn)癌癥診斷方面，主要在人體液體(血液或血清)或生物組織的微量元素分析及空間分布中發(fā)揮重要的作用[47]。在癌癥實(shí)體病腫瘤異質(zhì)性研究中，LIBS成像發(fā)現(xiàn)了正常皮膚與癌癥皮膚元素分布之間的明顯差異，針對(duì)人體皮膚組織及癌變細(xì)胞(如惡性黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌和默克爾細(xì)胞癌等)中Na、K、Mg和Ca等元素，結(jié)合生物組織算法聚類(lèi)分析，實(shí)現(xiàn)了元素分布信息與生物組織之間的精準(zhǔn)定位[48]。該方法還成功用于研究人體肺部樣本中元素(Ca、Mg、Na、C、Al、Fe、Si和Cu)以及分子片段(CN和C2)的元素分布，使用K-因子算法可對(duì)每個(gè)像素的元素信息進(jìn)行分類(lèi)研究，并發(fā)現(xiàn)了LIBS金屬成像在識(shí)別、定位和篩選肺病標(biāo)本臨床應(yīng)用的可行性[49]。LIBS在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，還需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)與醫(yī)學(xué)生物信息的多維性，以提高亞微米級(jí)分辨率對(duì)內(nèi)源性和外源性元素進(jìn)行成像與定量研究，目前的研究大多集中在元素的半定量基礎(chǔ)上[50]。在未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)中，對(duì)于元素分布中元素濃度的定量分析是臨床醫(yī)學(xué)必不可少的部分，微區(qū)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)樣品定量分析方法的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用將成為L(zhǎng)IBS成像在臨床研究中所面臨的巨大挑戰(zhàn)[51]。

 

3 LIBS成像的數(shù)據(jù)處理

LIBS成像具有非常高的動(dòng)態(tài)范圍、可檢測(cè)幾乎所有元素、收集速度快、空間分辨率高、適用微區(qū)樣品分析等特點(diǎn)，同時(shí)由于LIBS光譜呈現(xiàn)出眾多精細(xì)的發(fā)射譜線，導(dǎo)致其數(shù)據(jù)分析與處理工作量巨大[52]。一種由LIBS光譜簡(jiǎn)單快速生成元素圖像的方法是通過(guò)在特定波長(zhǎng)下對(duì)所選元素測(cè)量的信號(hào)進(jìn)行簡(jiǎn)單積分，從而生成其分布圖。但是該方法不能消除由于樣品基體不同或元素譜線重疊帶來(lái)的干擾，可能導(dǎo)致最終的元素分布圖存在一定的偏差[53]，因此在LIBS光譜數(shù)據(jù)批量分析中，通常還需要采用其他化學(xué)計(jì)量學(xué)手段對(duì)LIBS成像結(jié)果進(jìn)行分析處理。通過(guò)特定化學(xué)計(jì)量學(xué)手段的分析過(guò)程，通?？梢詮墓庾V圖中提取更多的化學(xué)信息，以提高LIBS數(shù)據(jù)結(jié)果的利用率[54]。LIBS光譜成像技術(shù)主要用于探索未知元素或含量的樣品，在后期數(shù)據(jù)分析中采用PCA法可實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)樣品模式下的定量分析[55]。PCA法可以快速獲得復(fù)雜樣品的初始化學(xué)信息，可以識(shí)別不同的相關(guān)或不相關(guān)元素，還能夠生成與每個(gè)組分間相關(guān)性指標(biāo)，以輔助檢測(cè)到的元素的空間分布圖[56]。例如LIBS成像可用于手寫(xiě)文件的鑒定研究，即使兩支鋼筆的書(shū)寫(xiě)差異目視無(wú)法分辨，LIBS成像也可為每種墨水產(chǎn)生不同的PCA組分分析結(jié)果，從而對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。這一應(yīng)用可用于證明官方手寫(xiě)文件的準(zhǔn)確性[57]。LIBS成像也被用于隱藏信息解密分析，通過(guò)對(duì)具有不同元素組成的墨水進(jìn)行掃描，能夠揭示手寫(xiě)文檔中隱藏的信息[58]。聚類(lèi)分析方法可以在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)樣品定量分析中發(fā)揮重要作用，該方法是按相似性對(duì)所有光譜進(jìn)行分組，作為簇在樣本特定區(qū)域中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。例如在識(shí)別組織病理學(xué)中，通過(guò)對(duì)皮膚樣本上采集的LIBS成像數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類(lèi)分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣品的一次數(shù)據(jù)采集就能確定腫瘤皮膚的邊緣，由此可以在觀察到的生物組織上分別顯示健康和癌細(xì)胞所在的區(qū)域[48]。在基于LIBS的成像分析中，因?yàn)闇y(cè)量是在單次拍攝過(guò)程中進(jìn)行的，因此沒(méi)有與圖像單個(gè)像素相關(guān)的強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，因此不能完整地實(shí)現(xiàn)定量分析。然而，可以使用各種類(lèi)型的模擬標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行“半定量”成像研究。最常見(jiàn)的校準(zhǔn)方法是使用已知濃度和成分的模擬標(biāo)準(zhǔn)樣品，模擬標(biāo)準(zhǔn)樣品與樣品的濃度和成分相似，然后采用相同的檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)試，以建立校準(zhǔn)模型[59]。LIBS成像的定量分析一直是限制其發(fā)展的重要挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的定量分析主要是通過(guò)特定區(qū)域光譜的強(qiáng)度和濃度進(jìn)行回歸分析[60]。但是在微區(qū)LIBS光譜批量分析中，很難獲得已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，不過(guò)在食品研究領(lǐng)域，可以通過(guò)偏最小二乘法(PLS)回歸來(lái)進(jìn)行牛肉、配方奶粉等樣本的初步定量研究[61]。LIBS成像微區(qū)定量分析未來(lái)發(fā)展還可結(jié)合信號(hào)分解法[62]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合聚類(lèi)分析[63]等方法對(duì)未知樣品的濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)與定量研究類(lèi)[64]。

 

4 結(jié)論

LIBS成像技術(shù)具有諸多優(yōu)勢(shì)，隨著在新實(shí)驗(yàn)方法、儀器開(kāi)發(fā)等方面的發(fā)展，其可能以低檢出限、出色靈敏度、高分辨率的成像優(yōu)勢(shì)在各個(gè)領(lǐng)域獲得更大的應(yīng)用空間。在未來(lái)的研究中，LIBS成像技術(shù)具有以下幾個(gè)發(fā)展方向：(1) 在數(shù)據(jù)處理階段還需要更專(zhuān)業(yè)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法來(lái)提取大量的光譜數(shù)據(jù)，以消除來(lái)自元素自吸收、光譜干擾等造成的測(cè)量偽影，導(dǎo)致樣品分析譜圖失真的影響；LIBS成像技術(shù)的發(fā)展離不開(kāi)新的數(shù)據(jù)處理概念和大量數(shù)據(jù)管理功能的進(jìn)步，使用人工智能進(jìn)行全自動(dòng)數(shù)據(jù)的分析與提取是未來(lái)LIBS成像化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展方向之一。(2) LIBS在檢測(cè)鹵族元素的能力較差，其檢出限可能在10-2級(jí)別，未來(lái)可以通過(guò)檢測(cè)自由基(如CaF或CaCl等)的較強(qiáng)分子發(fā)射間接測(cè)量這些元素，但是必須要確保這些自由基在等離子體中的可重復(fù)和可控性。(3) 對(duì)不同基體的復(fù)雜樣品進(jìn)行元素定量分析仍然是LIBS成像技術(shù)的巨大挑戰(zhàn)，可以采用其他微區(qū)表征技術(shù)如EPMA或LA-ICP-MS等輔助校準(zhǔn)LIBS圖像的定量結(jié)果，上述方法都亟需發(fā)現(xiàn)新標(biāo)準(zhǔn)樣品，以校準(zhǔn)或控制檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，同時(shí)在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)樣品前提下的微區(qū)定量研究也是推動(dòng)LIBS成像技術(shù)發(fā)展的重要手段。

 

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