抗體或Fc融合蛋白“去效應(yīng)功能化”的方法主要有兩種，包括：1）選擇與C1q及Fcγ受體親和力較低的亞類(lèi)（IgG2或IgG4）；2）引入特定點(diǎn)突變。早期的“沉默”突變包括：N297突變（去除糖基化位點(diǎn)）或L234A/L235A（LALA突變）。
然而，這些突變并不能完全消除與Fcγ受體的結(jié)合，也難以完全避免臨床上不期望的炎癥反應(yīng)。此后又發(fā)展出多種新的沉默突變，但由于各研究使用的檢測(cè)體系差異很大，缺乏系統(tǒng)比較，難以判斷哪種突變的效應(yīng)功能沉默效果最好（most effective silencing）。有團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一套Fab相同、Fc區(qū)各異的IgG抗體庫(kù)，涵蓋國(guó)際非專(zhuān)利名稱(chēng)（INN）數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)報(bào)道的全部亞類(lèi)與突變體，并系統(tǒng)比較了它們與人C1q的結(jié)合；與人、小鼠、食蟹猴Fcγ受體的結(jié)合；在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中的活性。
結(jié)果也比較有意思，即便殘余親和力極低的分子，也可在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著功能。迄今為止，臨床使用的所謂“沉默”設(shè)計(jì)幾乎沒(méi)有真正完全沉默的。
免疫球蛋白“效應(yīng)功能減弱”突變體目錄
參照INN數(shù)據(jù)庫(kù)和IMGT®數(shù)據(jù)庫(kù)，共計(jì)發(fā)現(xiàn)77種不同突變體可以潛在減弱Fc效應(yīng)功能，列表如下。其中有一些是用的比較多的“熱門(mén)”突變體，在INN列表中出現(xiàn)頻率最高的8種突變體包括：
IgG1 L234A/L235A；
IgG4 F234A/L235A；
IgG1 N297G;
IgG1 N297A;
IgG1 L234A/L235A/P329G;
IgG4 L235E;
IgG1 L234A/L235A/G237A；
IgG1 L234F/L235E/P331S。
利用表面等離子共振（SPR）檢測(cè)與Fcγ受體的結(jié)合
以CD20抗體作為模板序列。
野生型親和力概況：1）IgG1、IgG3：對(duì)所有檢測(cè)的FcγR均有顯著結(jié)合；2）IgG2：強(qiáng)結(jié)合人FcγRIIa-131H、猴FcγRIIa和FcγRIIb；對(duì)人FcγRIIa-131R及FcγRIIb結(jié)合弱；3）IgG4：強(qiáng)結(jié)合各物種FcγRI及FcγRIIa/FcγRIIb；引入S228P穩(wěn)定突變后結(jié)合力幾乎不變；4）IgG2/IgG4雜交型：對(duì)人受體結(jié)合顯著下降，但對(duì)猴受體結(jié)合基本保留。
完全沉默的突變體：1）234S/235T/236R（STR）三突變：無(wú)論置于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，對(duì)所有受體均無(wú)可測(cè)結(jié)合；2）IgG1-E233Δ/L234Δ/L235Δ同樣完全無(wú)信號(hào)；3）在IgG2或IgG2/1背景下，F(xiàn)296A/N297Q（去糖基化）也實(shí)現(xiàn)完全沉默。
部分沉默的“熱門(mén)”突變體：在INN中出現(xiàn)≥7次的“熱門(mén)”突變（如LALA系列或N297X去糖基化）仍能與≥2個(gè)FcγR產(chǎn)生可測(cè)結(jié)合，提示它們并非真正“沉默”。
單點(diǎn)突變效果：235、238、265、267、273、297、299、322、328、329、330、331等單點(diǎn)突變不足以完全阻斷FcγR結(jié)合。
與FcγRIIIa(158V)結(jié)合方面，STR三突變及若干其他突變體無(wú)結(jié)合。“熱門(mén)”突變體中（≥7個(gè)INN），僅N297A/G（去糖基化）無(wú)結(jié)合。
C1q結(jié)合（ELISA）
僅野生型IgG3（A????）和IgG1（A????）呈陽(yáng)性；其余所有突變體無(wú)可見(jiàn)結(jié)合。
采用Raji（CD20?B細(xì)胞）為靶細(xì)胞；Jurkat報(bào)告細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后攜帶NFAT-驅(qū)動(dòng)的熒光素酶基因，并表達(dá)不同人FcγR。利用Promega報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果顯示，野生型IgG3雖與受體結(jié)合高，但細(xì)胞活性遠(yuǎn)低于IgG1。部分SPR結(jié)合微弱的突變體，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示相對(duì)高活性。所有突變體對(duì)FcγRIIIa的SPR結(jié)合及Promega ADCC反應(yīng)幾乎均為陰性。
另外，采用Svar雙熒光報(bào)告系統(tǒng)，對(duì)Jurkat表達(dá)FcγRIIIa-158V、Jurkat表達(dá)FcγRIIa-131H的ADCC、ADCP進(jìn)行了檢測(cè)。
結(jié)果顯示，ADCP兩系統(tǒng)結(jié)果相關(guān)良好，但Svar相對(duì)信號(hào)略低。ADCC作用方面，Svar系統(tǒng)和Promega出現(xiàn)明顯差異，前者對(duì)多種突變體給出顯著信號(hào)。
關(guān)于“熱門(mén)”突變體（≥7個(gè)INN）的細(xì)胞活性：僅IgG1-L234A/L235A/P329G（LALAPG）在所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中為陰性；去糖基化N297G/N297A在FcγRI-介導(dǎo)ADCP中呈高活性；其余熱門(mén)突變體仍與≥2個(gè)受體有顯著ADCP。
共11種完全沉默的突變體（STR背景+4IgG1+2IgG2+2IgG4+1IgG2/1雜交）在所有ADCP/ADCC實(shí)驗(yàn)中均為陰性。
補(bǔ)體依賴(lài)細(xì)胞毒（CDC）
野生型IgG1、IgG3顯示出高活性。IgG2、IgG4野生型及所有突變體均無(wú)活性。
IgG1中表現(xiàn)高CDC的突變：1）去糖基化（N297A/G/Q/S/H）；2）L234A/G237A、L234F/L235E/D265A、L235A/G237A；3）單點(diǎn)突變：L235E、D265A、D265S。
其余突變體CDC均被有效沉默。
ADCC、ADCP、CDC結(jié)果如下表所示。
差示掃描熒光法（DSF）測(cè)定熱穩(wěn)定性
關(guān)鍵參數(shù)：Ton（起始熔解溫度）；Tm（第一熔解峰溫度）
質(zhì)控與判定標(biāo)準(zhǔn)
野生型IgG1：Ton=63.1℃，Tm=73.2℃
顯著降低閾值：Ton<61.9℃；Tm<72.6℃
野生型比較：IgG2、IgG3、IgG4的Ton與Tm均顯著低于IgG1。
IgG1突變體（51個(gè)）：30個(gè)突變體的Ton和/或Tm顯著降低。
降低最顯著：去糖基化突變（N297X、T299A）。
其他明顯降低的突變：L234F、L235E、P238S、D265A、V273E、K322A、L328R、P329G。
穩(wěn)定性增強(qiáng)：STR三突變（234S/235T/236R）在IgG1–IgG4四個(gè)亞類(lèi)中均使Ton與Tm提高2–4℃
討論
自1980年代初第一個(gè)治療性單抗OKT3進(jìn)入臨床以來(lái)，由“非預(yù)期炎癥反應(yīng)”引發(fā)的副作用始終是單抗療法的一大障礙。早期研究發(fā)現(xiàn)IgG4亞型在體內(nèi)似乎“惰性”較高，因此在需要避免炎癥的場(chǎng)景中優(yōu)先選用IgG4抗體。但后續(xù)工作揭示，由于FcγR家族成員眾多、且存在不同基因多態(tài)性，IgG4在多數(shù)情況下仍具有顯著生物學(xué)活性。TGN1412（IgG4抗-CD28）的災(zāi)難性臨床事件就是典型例證。
為徹底“沉默”Fc功能，研究者陸續(xù)開(kāi)發(fā)了多種Fc區(qū)突變體，最早出現(xiàn)的是N297A（無(wú)糖基化）和L234A/L235A（LALA）。這些突變體雖被廣泛應(yīng)用，但并未實(shí)現(xiàn)完全沉默，于是又出現(xiàn)了很多新的突變體。
本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)：1）IgG1在所有結(jié)合與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中均為強(qiáng)陽(yáng)性，作為參照；2）IgG2：FcγRI幾乎無(wú)活性；FcγRIIa強(qiáng)陽(yáng)性；FcγRIIb/III弱或陰性；CDC極弱；3）IgG3：所有FcγR結(jié)合及CDC均強(qiáng)陽(yáng)性；除Svar ADCC外，其余細(xì)胞實(shí)驗(yàn)反應(yīng)較弱；4）IgG4：FcγRI、FcγRIIa強(qiáng)陽(yáng)性；CDC陰性；FcγRIII結(jié)合及ADCC普遍弱。
絕大多數(shù)“沉默”突變體對(duì)FcγRIII幾乎無(wú)結(jié)合或功能（SPR或ADCC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）。
FcγRI與FcγRII的情況更復(fù)雜：多數(shù)突變體仍保留一定活性，有時(shí)甚至接近野生型。值得注意，SPR中僅顯示低親和力結(jié)合的突變體，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可能因抗體與受體均固定在細(xì)胞膜上而表現(xiàn)出更高“功能親和力”。
部分突變體能區(qū)分FcγRII亞型：IgG1L234A/L235A/G237A與L234A/L235E/G237A對(duì)131H-FcγRIIa和FcγRIIb活性高，卻對(duì)131R-FcγRIIa無(wú)活性。
158V-FcγRIIIa的活性一如既往地高于158F等位基因。
“全綠”突變體推薦（見(jiàn)上圖），唯一在所有檢測(cè)中均表現(xiàn)“綠燈”的是4種STR系列：1）IgG1和IgG3：L234S/L235T/G236R；2）IgG2：V234S/A235T/Δ236R；3）IgG4：F234S/L235T/G236R。
其它接近“全沉默”且熱穩(wěn)定性尚可的組合：1）E233P/L234A/L235A/G236Δ/P329A；2）E233P/L234V/G236Δ/S267K；3）L234A/L235A/P329S；4）L234A/L235A/D265S；5）L235G/G236R。
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