很多抗體的藥理活性主要由其Fc段決定，包括與補(bǔ)體蛋白C1q結(jié)合可啟動(dòng)補(bǔ)體依賴(lài)細(xì)胞毒作用（CDC）。與白細(xì)胞上的Fcγ受體結(jié)合，則介導(dǎo)抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用（ADCC）或抗體依賴(lài)的細(xì)胞吞噬作用（ADCP）。與新生兒Fc受體（FcRn）結(jié)合，使IgG獲得較長(zhǎng)的血清半衰期。
通過(guò)對(duì)Fc部位的點(diǎn)突變可以改變抗體與Fc受體的親和力，以增強(qiáng)CDC、ADCC和/或ADCP活性。然而，尚缺乏對(duì)這些不同變體的系統(tǒng)比較。有研究以抗CD20抗體rituximab的Fab為固定骨架，構(gòu)建了21株含不同F(xiàn)c突變的抗體，并在細(xì)胞模型中系統(tǒng)比較了它們的活性。同時(shí)，評(píng)估了各變體的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)許多變體相比野生型有所下降。21株抗體對(duì)應(yīng)的Fc突變，列表如下。
使用Promega的Fc效應(yīng)細(xì)胞生物活性報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，評(píng)估抗CD20抗體與細(xì)胞Fcγ受體的結(jié)合能力，從而間接反映其介導(dǎo)ADCP或ADCC的潛力。
靶細(xì)胞采用CD20陽(yáng)性人B淋巴細(xì)胞系Raji，效應(yīng)細(xì)胞用的是轉(zhuǎn)染了特定人Fc受體，并攜帶由NFAT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因Jurkat細(xì)胞系。
EC50值與野生型IgG1相比差異在3倍以?xún)?nèi)，視為“中性”；低于3倍，視為“增強(qiáng)”；高于3倍：視為“降低”。
結(jié)果總結(jié)于下表，主要發(fā)現(xiàn)如下：
野生型IgG3：盡管與重組Fc受體結(jié)合力強(qiáng)，但在所有ADCC/ADCP實(shí)驗(yàn)中活性極低。
FcγRI介導(dǎo)的ADCP：無(wú)變體表現(xiàn)出增強(qiáng)活性，部分明顯降低。
FcγRIIIa介導(dǎo)的ADCC（兩種等位基因）：22個(gè)變體中，14個(gè)表現(xiàn)出增強(qiáng)活性，尤其對(duì)158F等位基因（通常與IgG1結(jié)合較弱）增強(qiáng)更明顯；5個(gè)活性降低，3個(gè)無(wú)顯著變化。
FcγRII相關(guān)活性：7個(gè)變體無(wú)增強(qiáng)；12個(gè)僅對(duì)某一亞型或等位基因有增強(qiáng)；3個(gè)對(duì)所有三種形式均有增強(qiáng)。
補(bǔ)體依賴(lài)細(xì)胞毒作用（CDC）
使用Svari Lite檢測(cè)系統(tǒng)評(píng)估全部變體的CDC活性。靶細(xì)胞采用表達(dá)CD20的人B細(xì)胞系Ramos，轉(zhuǎn)染并表達(dá)Svar熒光素酶。
結(jié)果見(jiàn)上表，顯示野生型IgG3與IgG1活性相當(dāng)；11個(gè)變體與IgG1持平（綠色部分）；6個(gè)變體CDC增強(qiáng)（藍(lán)色部分）；5個(gè)變體CDC減弱或幾乎喪失（紅色部分）。
熱穩(wěn)定性
采用Protein Stable SUPR-DSF系統(tǒng)的差示掃描熒光法（DSF）測(cè)定。
分析指標(biāo)：Ton（起始熔解溫度）；Tm（第一熔解峰溫度，對(duì)應(yīng)CH2結(jié)構(gòu)域）
野生型IgG1：Ton=63.1℃；Tm=73.2℃
判定標(biāo)準(zhǔn)：Ton<61.9℃（<3×誤差）為顯著降低；Tm<72.6℃為顯著降低
結(jié)果顯示，22個(gè)變體中，18個(gè)Ton與Tm均顯著降低，部分下降超過(guò)20℃；僅4個(gè)變體的熱穩(wěn)定性與野生型IgG1相當(dāng)。
討論
增強(qiáng)FcγR結(jié)合策略的根本目的是提高抗體殺傷腫瘤的效力，但究竟應(yīng)優(yōu)先增強(qiáng)ADCP（FcγRI或FcγRIIa介導(dǎo)）、ADCC（FcγRIIIa介導(dǎo)）、CDC，還是減弱抑制性受體FcγRIIb的負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)，抑或多種效應(yīng)聯(lián)合優(yōu)化，目前尚無(wú)定論，且“增強(qiáng)到何種程度”也缺乏共識(shí)。本研究采用了一組V區(qū)與IgG1同種異型完全一致的抗體（均以利妥昔單抗的V區(qū)為骨架），采用常規(guī)、可重復(fù)的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)（ADCC、ADCP、CDC）進(jìn)行平行比較，并用高通量DSF檢測(cè)熱穩(wěn)定性。所用變體涵蓋WHO INN名單（截至2022年4月）、IMGT收錄及文獻(xiàn)報(bào)道的其他突變。
FcγRI受體與ADCP相關(guān)，研究顯示，幾乎沒(méi)有專(zhuān)門(mén)增強(qiáng)FcγRI結(jié)合或ADCP的突變。測(cè)試的變體大多無(wú)明顯提升；最強(qiáng)的增強(qiáng)僅為1.87倍（S239D/A330L/I332E），7個(gè)變體活性反而下降3倍以上。
提高ADCC的手段最早、最廣泛應(yīng)用的是降低Fc糖基化的巖藻糖含量，即去巖藻糖化（Afucosylation）。截至2023年底，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)7款去巖藻糖抗體（amivantamab、belantamab mafodotin、benralizumab、inebilizumab、mogamulizumab、obinutuzumab、ublituximab），通常通過(guò)在缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞系中表達(dá)實(shí)現(xiàn)。去巖藻糖變體在FcγRIIIa-158V效應(yīng)細(xì)胞中ADCC提高31倍，在158F細(xì)胞中提高201倍；但ADCP（FcγRI或FcγRII各亞型）未見(jiàn)明顯變化。
單點(diǎn)突變F243L與T393A，這兩個(gè)單點(diǎn)突變單獨(dú)存在時(shí)未顯著提升ADCC、ADCP或CDC。它們最初是在核糖體展示篩選出的三突變體F243L/T393A/H433P中被認(rèn)為對(duì)ADCC有貢獻(xiàn)。T393A也出現(xiàn)在Fc融合蛋白conbercept中，但未給出選用理由。
CDC專(zhuān)用突變E430G與K326W/E333S，這兩個(gè)變體專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于增強(qiáng)CDC。E430G使CDC提高6倍，但ADCC與FcγRIIa介導(dǎo)的ADCP下降。K326W/E333S則使CDC提高7倍，伴隨ADCC、ADCP下降。
多功能突變G236A/S267E/H268F/S324T/I332E，該五聯(lián)突變對(duì)所有FcγRII亞型（包括抑制性FcγRIIb）的ADCP均增強(qiáng)，CDC也增強(qiáng)，但ADCC無(wú)顯著變化。值得注意的是，它對(duì)FcγRIIb的提升高于FcγRIIa，這解釋了為何以前用共表達(dá)兩種受體的巨噬細(xì)胞檢測(cè)時(shí)未觀察到ADCP凈增加。
S267E、S267E/L328F、N325S/L328F三種突變體對(duì)FcγRIIIa-介導(dǎo)的ADCC完全失活；對(duì)FcγRIIa-131H的ADCP基本不變，但可顯著提升對(duì)FcγRIIa-131R和抑制性受體FcγRIIb的ADCP。CDC活性則各不相同：S267E提高3倍，S267E/L328F基本不變，N325S/L328F完全喪失。
14種突變體顯著提升ADCC，且對(duì)低親和力等位基因FcγRIIIa-158F的提升（17-333倍）遠(yuǎn)高于對(duì)高親和力158V的提升（12-62倍）。
在ADCP與CDC方面，各突變體表現(xiàn)各異。L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L，對(duì)FcγRIIa-131R無(wú)增強(qiáng)，但對(duì)131H與FcγRIIb有增強(qiáng)；CDC不變。S298A/E333A/K334A，ADCP不變，CDC增強(qiáng)；G236A/A330L/I332E與G236A/S239D/A330L/I332E，對(duì)兩種FcγRIIa亞型均增強(qiáng)ADCP，但對(duì)FcγRIIb無(wú)變化且CDC完全喪失；G236A/H268F/S324T/I332E，ADCP類(lèi)似，CDC輕度增強(qiáng)；S239D/K274Q/Y296F/Y300F/L309V/I332E/A339T/V397M與G236A/S239D/I332E，對(duì)所有FcγRII亞型均顯著增強(qiáng)ADCP，CDC變化不大。值得注意的是，tafasitamab與talacotuzumab文獻(xiàn)常僅提S239D/I332E，其實(shí)際序列為8突變體，活性遠(yuǎn)高于S239D/I332E雙突變。S239D/A330L/I332E與S239D/I332E相比，對(duì)FcγRIIa-131R的ADCP降至野生型水平且CDC消失。P247I/A339Q、
F243L/R292P/Y300L/V305L/P396I、D270E/K326D/A330M/K334E及異二聚體
Fc(L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A//D270E/K326D/A330M/K334E）四種突變體均提升對(duì)FcγRIIa-131H的ADCP，對(duì)131R與FcγRIIb無(wú)變化；CDC則分別為下降8倍、上升6倍、基本不變、基本不變。
腫瘤治療通常期望高ADCC且FcγRIIa:FcγRIIb激活/抑制比高。按此標(biāo)準(zhǔn)，G236A/S239D/A330L/I332E表現(xiàn)最優(yōu)，但A330L使其CDC完全喪失；去掉A330L（G236A/S239D/I332E）可恢復(fù)CDC，卻顯著提高了對(duì)抑制性FcγRIIb的結(jié)合。若CDC必須保留，F(xiàn)243L/R292P/Y300L/V305L/P396I是較好折中方案。迄今為止，尚未出現(xiàn)同時(shí)理想提升ADCC、ADCP、CDC且無(wú)FcγRIIb副作用的“完美”突變。
還需要注意的是，各突變體的熱穩(wěn)定性普遍下降。22個(gè)變體中18個(gè)熱穩(wěn)定性顯著降低，CH2結(jié)構(gòu)域Tm最多下降21℃?；钚宰罡叩腉236A/S239D/A330L/I332E與G236A/S239D/I332E恰是下降最嚴(yán)重者（≈20℃）。異二聚體Fc雖經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以提高穩(wěn)定性，Tm仍下降約16°C。熱穩(wěn)定性降低可能影響生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)、聚集及免疫原性，需逐一評(píng)估。
與大量“沉默型”突變抗體已上市相比，真正進(jìn)入臨床的增強(qiáng)型突變極少。原因可能包括：可選方案過(guò)多，決策困難；熱穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)阻礙商業(yè)化。
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