膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma,GBM）是最具侵襲性且最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤。目前，手術(shù)、放療和化療仍是主要治療手段。在GBM中，EGFR變異體III（EGFRvIII）是EGFR最常見的基因改變形式，可導(dǎo)致該蛋白持續(xù)活化。EGFRvIII約出現(xiàn)在30%的GBM病例中，且在正常組織中完全不存在，因此被視為理想的腫瘤特異性免疫治療靶點。
由于EGFRvIII在健康動物中不表達，傳統(tǒng)非臨床安全性評估（如在轉(zhuǎn)基因小鼠或食蟹猴中）僅能評估脫靶毒性。而對EGFRvIII/CD3雙特異性分子而言，在藥理學(xué)無關(guān)物種中進行毒理研究價值有限。
GBM中EGFRvIII的表達具有高度異質(zhì)性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)差異大，使得首次人體試驗（FIH）劑量的選擇極具挑戰(zhàn)——既不能過低（無效），也不能過高（不安全）。對于免疫激動類分子，起始劑量通常基于最小預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)水平（MABEL），主要依據(jù)最敏感的2D體外系統(tǒng)數(shù)據(jù)。但這往往導(dǎo)致起始劑量極低，需多次劑量遞增才能達到治療窗。此外，腫瘤引起的血腦屏障（BBB）破壞具有區(qū)域異質(zhì)性，部分區(qū)域BBB完整、部分破壞，進一步增加了劑量選擇的復(fù)雜性。
根據(jù)ICH指南，F(xiàn)IH前的非臨床研究通常需在藥理相關(guān)動物種屬中評估靶點相關(guān)及脫靶毒性。若無相關(guān)種屬，則建議使用表達人源受體的轉(zhuǎn)基因動物；若仍不可行，ICH S6指南允許在單一物種中開展有限毒性評估。
來看羅氏團隊分享的一個案例，該案例以體外實驗為核心，成功替代了傳統(tǒng)非臨床安全評估策略，成功支持了新型EGFRvIII靶向T細胞雙特異性抗體EGFRvIII-TCB（也稱RO7428731或RG6156）的FIH臨床試驗（NCT05187624）。這一以體外實驗為主導(dǎo)的轉(zhuǎn)化策略獲得了歐洲、美國、加拿大和澳大利亞監(jiān)管機構(gòu)的批準。截至報告時，該FIH I期臨床試驗已對超過30名患者給予EGFRvIII-TCB治療。
研究方法
EGFRvIII-TCB和DP47-TCB均為基于IgG的2:1雙特異性抗體（兩個腫瘤靶點結(jié)合域+一個CD3結(jié)合域）。AMG596 BiTE（雙特異性T細胞銜接器）根據(jù)專利WO/2017/021370中的SEQID NO:160合成。
非臨床研究內(nèi)容總結(jié)如下表所示：
起始劑量確定策略
MABEL：基于3D模型中最敏感讀出指標（腫瘤殺傷）的30%藥理活性（PA30），對應(yīng)人體起始劑量的Cmax。
最小藥理活性劑量（mPAD）：定義為在異種移植模型中產(chǎn)生最小腫瘤生長抑制（TGI）所需的暴露量。
預(yù)期治療劑量（ATD）范圍：設(shè)定為腦ISF中藥物濃度達到體外2D/3D模型EC90及體內(nèi)TGI所需濃度的劑量區(qū)間。
結(jié)果
1.EGFRvIII-TCB的靶向殺傷作用
EGFRvIII-TCB在與PBMC共培養(yǎng)體系中，以劑量依賴方式特異性裂解表達EGFRvIII的靶細胞。
EGFRvIII表達水平影響敏感性：高表達細胞（U87MGhigh）對殺傷更敏感；低表達細胞（U87MGlow）敏感性較低。
與AMG596的效力比較，在低EGFRvIII表達細胞中，EGFRvIII-TCB與AMG596的EC50相當；但在高表達細胞中，EGFRvIII-TCB藥效更優(yōu)，AMG596效力明顯更低。
2.GBM-BBB類器官模型中的藥物滲透與定位
非靶向IgG無法穿透正常BBB類器官，說明其低通透性。但當類器官中加入U87MG-EGFRvIII腫瘤細胞后，非靶向IgG可在內(nèi)部積累，
表明腫瘤導(dǎo)致BBB通透性增加。
EGFRvIII-TCB在GBM-BBB類器官中呈劑量依賴性積累，并特異性富集于部分細胞。相比之下，非靶向?qū)φ誘CB呈彌散分布。
3.腫瘤細胞殺傷的特異性與劑量效應(yīng)
EGFRvIII-TCB和AMG596均誘導(dǎo)劑量依賴性腫瘤殺傷（圖2）：0.1nM EGFRvIII-TCB即可顯著降低U87MG-EGFRvIII細胞的RFP熒光信號；AMG596需要1nM才達到類似效果。
定量分析顯示：EGFRvIII-TCB的平均EC50為0.016–0.03nM；AMG596為0.3nM，進一步證明EGFRvIII-TCB更高效。
二、人體劑量范圍預(yù)測（基于PK/PD模型）
1.人體PK預(yù)測方法
結(jié)合體外共培養(yǎng)系統(tǒng)（人腫瘤細胞+免疫效應(yīng)細胞）與體內(nèi)異種移植模型，采用基于生理的藥代動力學(xué)（PBPK）模型，考慮腦內(nèi)局部藥物濃度。系統(tǒng)暴露通過異速縮放法預(yù)測（假設(shè)BBB完整）。
線性PK假設(shè)基于表達人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠（hFcRntg32）單次給藥研究。
腦內(nèi)藥物濃度校正
在健康大鼠中，前額葉皮層ISF中的藥物濃度約為血清的1.2%；該比例用于預(yù)測BBB完整患者的有效劑量范圍。
2.MABEL策略
采用最敏感讀出指標——腫瘤細胞殺傷。
在3D GBM-BBB模型中設(shè)定30%藥理活性（PA30）作為MABEL目標（FDA. Bispecific Antibody Development Programs Guidance for Industry. 2021）；
基于EC50=0.016nM，根據(jù)Hill等式，推算PA30≈0.007nM（即0.0013μg/mL）；
假設(shè)初始分布容積為3100mL血清，計算出起始劑量為0.004mg，可達到Cmax=0.0013μg/mL（如下表）。
該Cmax比3D模型中IL-6釋放的EC50低約6倍。比人源化NSG小鼠皮下模型中產(chǎn)生最小TGI所需的穩(wěn)態(tài)濃度（Cavg,ss）低約18倍；比人全血實驗（WBA）中引發(fā)細胞因子釋放的濃度低>7000倍；也遠低于在表達胃泌素的HEK細胞中引起顆粒酶B和IFNγ升高的濃度。
通過AMG596臨床數(shù)據(jù)驗證MABEL方法可靠性
在相同3D模型中，AMG596的PA30為7ng/mL（分子量55kDa），其I期臨床起始劑量（4.5μg /天）對應(yīng)的Cavg,ss僅為PA30的～1/7.4。臨床試驗中，從4.5μg /天到1000μg /天均未報告藥物相關(guān)不良反應(yīng)。提示起始劑量45–150μg /天是安全的，從而增強了MABEL策略的可信度。
3.治療劑量范圍預(yù)測
最小藥理活性劑量（mPAD）：預(yù)測為0.4mg，Q3W，對應(yīng)小鼠模型中觀察到TGI的暴露水平（0.02mg/kg）。
預(yù)期治療劑量（ATD）范圍（假設(shè)BBB完整，為療效高壁壘場景）：預(yù)測為80–330mg Q3W，確保腦ISF中藥物濃度達到高EGFRvIII表達3D模型的EC90，或低表達2D細胞系的EC90，或皮下異種移植模型中的有效濃度。
三、潛在脫靶毒性評估
1.對EGFRwt的交叉反應(yīng)性評估
使用原代人肝細胞構(gòu)建的肝類器官，與人PBMC共培養(yǎng)，檢測EGFRvIII-TCB是否對表達EGFRwt的正常肝細胞產(chǎn)生殺傷。
結(jié)果：EGFRvIII-TCB在所有測試濃度下引起的LDH釋放水平與非靶向?qū)φ誘CB（DP47-TCB）相當，表明其對人肝細胞無脫靶毒性，不識別EGFRwt。
2.人正常組織交叉反應(yīng)性研究
EGFRvIII-TCB在多種人正常組織切片中產(chǎn)生染色：預(yù)期染色在淋巴組織和部分非淋巴組織的單核白細胞膜和胞漿（因其含CD3）；非預(yù)期染色在多種上皮細胞、平滑肌、神經(jīng)元、視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮、心肌和骨骼肌的胞漿中觀察到信號。
毒理學(xué)意義評估：根據(jù)監(jiān)管共識，抗體藥物通常無法進入活細胞胞漿，因此胞漿結(jié)合一般被認為無顯著毒理風(fēng)險。
3.人質(zhì)膜蛋白微陣列篩選（Retrogenix™）
EGFRvIII-TCB特異性結(jié)合兩個已知靶點：EGFRvIII；CD3ε（當與CD3δ形成異源二聚體時）。
意外發(fā)現(xiàn)：與前胃泌素有強相互作用。該結(jié)合也被EGFRvIII-IgG陽性對照抗體檢出，并通過流式細胞術(shù)驗證。
無序列同源性：EGFRvIII與前胃泌素之間無氨基酸序列相似性，提示為構(gòu)象依賴性交叉反應(yīng)。
開展了進一步的機制驗證。SPR顯示，EGFRvIII-TCB可結(jié)合重組人前胃泌素。對膜錨定形式的胃泌素-71表現(xiàn)出雙價結(jié)合（表觀親合力KD≈7.5nM）；而對EGFRvIII抗原的親合力高達40pM，顯示對真實靶點選擇性遠高于胃泌素。
氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）定位結(jié)合表位：結(jié)合區(qū)域包括氨基酸69–72（存在于除胃泌素-17外的所有分泌型胃泌素中）；氨基酸81–92（存在于所有分泌型胃泌素中）。
4.胃泌素介導(dǎo)的潛在T細胞殺傷風(fēng)險評估
胃泌素是分泌型肽，正常情況下不表達于細胞膜表面。為評估最壞情況，使用Retrogenix構(gòu)建的膜錨定胃泌素-71或前胃泌素的HEK293細胞（模擬“理論上的最不利場景”）。
結(jié)果顯示：
HEK-EGFRvIII+PBMC：EGFRvIII-TCB引起顯著LDH釋放和Granzyme B、IFNγ、IL-2、IL-6、IL-10、TNFα等細胞因子升高。
HEK-胃泌素（膜錨定）+PBMC：無LDH釋放，表明無細胞殺傷；在10μg/mL濃度下，可檢測到輕度GranzymeB和IFNγ釋放，但顯著低于EGFRvIII陽性組。
結(jié)論：即使在人為強制胃泌素表達于細胞膜的極端條件下，EGFRvIII-TCB也未引發(fā)有效T細胞介導(dǎo)的殺傷。考慮到體內(nèi)胃泌素幾乎不可能錨定于細胞表面，該脫靶結(jié)合臨床相關(guān)性極低。
5.人全血細胞因子釋放實驗（WBA）
EGFRvIII-TCB在人全血中誘導(dǎo)的細胞因子釋放水平：與非靶向TCB（DP47-TCB）相當；遠低于高風(fēng)險陽性對照alemtuzumab。
原因：人全血中無EGFRvIII表達細胞，故無靶向激活。
額外測試：在全血中加入胃泌素-17或胃泌素-34，未增強EGFRvIII-TCB的非靶依賴性細胞因子釋放，進一步排除胃泌素介導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫激活風(fēng)險。
6.對人心肌細胞的潛在毒性（hiPSC-CMs模型）
使用人誘導(dǎo)多能干細胞來源的搏動心肌細胞（iCell Cardiomyocytes）+PBMC共培養(yǎng)體系。檢測指標包括自發(fā)搏動頻率、細胞完整性、活力（通過阻抗和場電位監(jiān)測）。
結(jié)果顯示，EGFRvIII-TCB和DP47-TCB不影響心肌細胞搏動頻率、完整性和活力。EGFRvIII-TCB無直接心臟毒性。
討論
以體外新方法（NAMs）替代動物實驗：EGFRvIII-TCB的非臨床安全評估策略。
1.行業(yè)趨勢與挑戰(zhàn)
制藥行業(yè)致力于減少或替代動物實驗，推動采用新方法學(xué)（New Approach Methodologies, NAMs）。盡管體外系統(tǒng)在靶點藥理機制研究方面已較成熟，但脫靶毒性可能影響任意分子、細胞或組織。
要完全替代動物模型，理想的體外系統(tǒng)需具備：血管化的多器官芯片（“人體芯片”），完整模擬器官功能，包含組織駐留免疫細胞、神經(jīng)支配和封閉循環(huán)系統(tǒng)，整合神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的復(fù)雜信號。
現(xiàn)狀局限：當前多數(shù)體外模型僅模擬器官局部區(qū)域，缺乏關(guān)鍵細胞類型、神經(jīng)支配和系統(tǒng)交互，無法完全復(fù)現(xiàn)體內(nèi)復(fù)雜性。
2.為何適用于EGFRvIII-TCB？
抗體藥物通常高度特異于人源靶點。當無藥理相關(guān)動物種屬（如EGFRvIII在健康動物中不表達）時，人源體外系統(tǒng)成為必要選擇。
T細胞招募型雙抗（如EGFRvIII-TCB）具有明確的毒性讀出指標（如細胞因子釋放、T細胞激活），便于體外評估。然而，因體外系統(tǒng)簡化，其毒性預(yù)測風(fēng)險更高，需通過嚴格的臨床風(fēng)險管理彌補，例如基于MABEL設(shè)定極低的FIH起始劑量。
3.EGFRvIII-TCB的FIH開發(fā)包獲全球監(jiān)管認可
非臨床安全性、起始劑量及有效劑量預(yù)測完全基于體外數(shù)據(jù)，該策略已獲FDA、EMA等全球多個監(jiān)管機構(gòu)批準。
截至目前，I期臨床試驗（NCT05187624）已對>30名膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）患者給藥，未報告重大安全問題。
4.PK預(yù)測策略
因EGFRvIII在健康動物中不表達，無法在非人靈長類中建立可外推至人的PK/PD關(guān)系；
改用hFcRn轉(zhuǎn)基因小鼠（Tg32）預(yù)測人體PK：該模型缺失鼠源FcRn，表達人FcRn，遺傳背景均一（C57BL/6J），適用于預(yù)測線性清除過程下的系統(tǒng)暴露。
保守性假設(shè)：未考慮靶點介導(dǎo)的藥物清除（TMDD），因此預(yù)測的是最大可能暴露量，偏安全。
5.有效劑量（ATD）范圍預(yù)測：聚焦腦內(nèi)局部暴露
考慮到GBM患者即使手術(shù)切除強化病灶后仍會復(fù)發(fā)，假設(shè)BBB完整是評估療效的最高壁壘。有效劑量需確保在BBB完整條件下，腦組織間液（ISF）中藥物濃度達到體外模型中的藥理活性水平（如EC90）。
6.起始劑量選擇：平衡安全與臨床緊迫性
起始劑量定為0.004mg（無預(yù)激或階梯遞增），旨在避免傳統(tǒng)MABEL方法導(dǎo)致起始劑量過低、延誤治療的問題。對GBM患者而言，所有患者均存在BBB完整的腫瘤區(qū)域，亟需快速進入有效劑量窗。
7.為何選擇3D GBM-BBB模型而非傳統(tǒng)2D模型？
3D模型更生理相關(guān)，模擬腫瘤誘導(dǎo)的BBB破壞；更準確預(yù)測體內(nèi)藥效。2D模型則顯著高估抗腫瘤效應(yīng)。
監(jiān)管機構(gòu)起初要求以2D模型作為起始劑量依據(jù)，為此團隊進行了回溯性驗證。使用同類藥物AMG596（相同作用機制，已有臨床數(shù)據(jù)）在3D模型中預(yù)測PA30。結(jié)果顯示，預(yù)測濃度與AMG596 I期起始劑量對應(yīng)的穩(wěn)態(tài)濃度一致，且臨床耐受良好，無藥物相關(guān)不良反應(yīng)。由此驗證了3D模型的可靠性，增強監(jiān)管信心。
8.監(jiān)管對體外終點選擇的反饋與最終決策
最初提議以3D模型中細胞因子釋放的EC50作為MABEL基礎(chǔ)。監(jiān)管機構(gòu)要求提供更多2D與3D模型中細胞因子上調(diào)的對比數(shù)據(jù)。團隊證明兩者細胞因子釋放模式定性一致。
最終采納FDA《雙特異性抗體開發(fā)指南》建議：以最敏感讀出指標——腫瘤細胞殺傷的PA30作為MABEL目標。該建議基于對17個CD3雙抗FIH劑量的回顧分析：PA30對所有分子均安全，PA50除一個例外外也安全。最終，基于高EGFRvIII表達3D模型的PA30（0.007nM）被全球監(jiān)管機構(gòu)廣泛接受為EGFRvIII-TCB的起始劑量依據(jù)。
9.靶向毒性（On-target Toxicity）的管理
體外模型（如GBM-BBB類器官）缺乏神經(jīng)元和真實腫瘤微環(huán)境，不適合評估靶向毒性（如神經(jīng)毒性、局部炎癥）；
為此，臨床方案中納入：針對性神經(jīng)系統(tǒng)監(jiān)測；CRS和神經(jīng)毒性管理指南。
10.當前體外模型的局限性與未來方向
（1）模型復(fù)雜性不足
多數(shù)3D模型源自iPSC，分化受培養(yǎng)條件影響，難以包含所有相關(guān)細胞類型（如胃類器官中缺乏G細胞），細胞表型可能不完全成熟或偏離體內(nèi)狀態(tài)。
（2）脫靶篩選與驗證策略
細胞蛋白微陣列（如Retrogenix）可無偏倚篩查脫靶結(jié)合。建議采用分層評估策略，僅對表達靶點或脫靶蛋白的細胞/組織進行深入安全性測試。
脫靶結(jié)合必須通過功能性實驗驗證：優(yōu)先使用原代人細胞（具生理性表達水平）；若不可得（如胃泌素G細胞），可用轉(zhuǎn)染細胞或iPSC分化細胞，但需注意其表達水平可能失真，僅支持定性風(fēng)險評估。
本研究中，EGFRvIII-TCB與胃泌素的弱結(jié)合：未引起HEK細胞殺傷，未增強全血細胞因子釋放，組織交叉反應(yīng)性研究中無對應(yīng)染色，表明臨床風(fēng)險極低。
（3）微陣列技術(shù)的敏感性與解讀
該技術(shù)基于過表達膜蛋白，可檢測至微摩爾級弱相互作用。需更多功能性隨訪數(shù)據(jù)，以確定何種親和力閾值構(gòu)成“可靠脫靶”，值得下游驗證。
11.體外模型“資格認證”（Qualification）的關(guān)鍵：參照化合物
使用體外系統(tǒng)前，必須通過陽性/陰性對照證明其可轉(zhuǎn)化性。理想情況下，應(yīng)有作用機制相似的臨床化合物用于“校準”模型。本研究通過AMG596的已知臨床數(shù)據(jù)成功“認證”了3D GBM-BBB模型。
挑戰(zhàn)：對于全新機制藥物，往往缺乏參考化合物或臨床數(shù)據(jù)，使體外模型建立和監(jiān)管接受更具難度。
京公網(wǎng)安備11010802046783號
