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1 目的與范圍

1.1 目的

建立標(biāo)準(zhǔn)化的微生物限度實驗操作規(guī)程，規(guī)范非無菌產(chǎn)品的微生物計數(shù)及控制菌檢查流程，確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、可追溯，符合2025年版《中華人民共和國藥典》（四部）要求，為產(chǎn)品質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1.2 范圍

本規(guī)程適用于2025年版藥典規(guī)定的非無菌藥品、藥用輔料、藥品內(nèi)包裝材料（膜、袋等）及純化水等的微生物限度檢查，包括需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)，以及指定控制菌的檢出與鑒定。

 

2 引用標(biāo)準(zhǔn)與依據(jù)

本規(guī)程依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)制定：

•《中華人民共和國藥典》2025年版四部 通則1105《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法》；

•《中華人民共和國藥典》2025年版四部 通則1106《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法》；

•《藥品微生物實驗室質(zhì)量管理規(guī)范》。

 

3 實驗前準(zhǔn)備

3.1 實驗環(huán)境要求

1.實驗需在B級潔凈背景下的A級潔凈工作臺（或生物安全柜）內(nèi)進行，操作前30分鐘開啟潔凈工作臺及紫外消毒裝置，消毒30分鐘后關(guān)閉紫外，通風(fēng)15分鐘后方可開始操作。

2.實驗環(huán)境溫度控制在18-26℃，相對濕度45%-65%，定期監(jiān)測并記錄環(huán)境潔凈度及溫濕度。

3.實驗過程中禁止無關(guān)人員進入潔凈區(qū)域，避免交叉污染。

3.2 器材與培養(yǎng)基準(zhǔn)備

1.實驗器材（移液管、培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶、濾器等）需經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，滅菌后置于無菌環(huán)境中保存，有效期不超過7天，使用前確認(rèn)無破損、污染。

2.培養(yǎng)基選用符合藥典要求的成品或自制培養(yǎng)基，使用前需進行適用性檢查：

?胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）用于需氧菌總數(shù)計數(shù)；

?沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）用于霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)；

?膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基等用于控制菌檢查（按需選用）。

3.培養(yǎng)基需提前復(fù)溫至室溫，熔化后溫度控制在45-50℃（避免高溫?fù)p傷微生物或低溫凝固），確認(rèn)無渾濁、沉淀、雜菌污染后方可使用。

3.3 菌種與菌液制備

1.試驗用菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），采用低溫冷凍、凍干等適宜方法保藏，確保菌種活性與純度。

2.菌液制備：

?細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等）：取新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液；

?真菌（白色念珠菌、黑曲霉）：白色念珠菌制備方法同細(xì)菌；黑曲霉需用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的上述緩沖液洗脫孢子，制成孢子懸液。

3.菌液制備后室溫放置不超過2小時，2-8℃冷藏保存不超過24小時；黑曲霉孢子懸液可在驗證合格的貯存期內(nèi)冷藏使用。

3.4 樣品準(zhǔn)備

1.樣品采集需使用無菌容器，純化水采樣前需放水3-5分鐘沖洗管道，收集至少200ml樣品；固體/半固體樣品隨機抽取不少于2個最小包裝，混合均勻后取樣。

2.樣品需在采集后4小時內(nèi)完成檢測，無法即時檢測的樣品需于2-8℃冷藏保存，保存時間不超過24小時，檢測前恢復(fù)至室溫并搖勻。

 

4 實驗操作流程

4.1 微生物計數(shù)法（平皿法/薄膜過濾法）

4.1.1 計數(shù)方法適用性檢查

正式檢測前需進行方法適用性試驗，確認(rèn)所選方法可有效檢出供試品中的微生物，步驟如下：

1.供試液制備：        

供試液從制備到接種培養(yǎng)基的時間不得超過1小時，加溫制備時溫度不超過45℃。

?固體/液體供試品：取供試品加適宜稀釋液（pH7.0緩沖液、0.9%氯化鈉溶液等），制成1:10供試液，必要時調(diào)節(jié)pH至6-8，進一步進行10倍系列稀釋；

?內(nèi)包裝膜/袋：取100cm²樣品剪碎，加入稀釋液浸泡、振搖，制成1:10供試液。

2.分組接種：  

?試驗組：取供試液加入試驗菌液，使每1ml供試液含菌量不超過100cfu，混勻；

?供試品對照組：取供試液，以稀釋液替代菌液，同試驗組操作；

?菌液對照組：取稀釋液替代供試液，加入試驗菌液，同試驗組操作；

?陰性對照組：以稀釋液替代供試液，無接種菌液，驗證實驗環(huán)境與器材無菌性。

3.培養(yǎng)與結(jié)果判斷：

結(jié)果需滿足：試驗組菌落數(shù)（減去供試品對照組菌落數(shù)）與菌液對照組菌落數(shù)的比值在0.5-2范圍內(nèi)，陰性對照無菌生長，方法方可使用。

?平皿法：取1ml各組溶液注入無菌培養(yǎng)皿，加入熔化的培養(yǎng)基混勻，凝固后倒置培養(yǎng)（TSA 30-35℃培養(yǎng)3-5天，SDA 20-25℃培養(yǎng)5-7天）；

?薄膜過濾法（適用于抑菌性供試品）：選用孔徑≤0.45μm濾膜，供試液過濾后用沖洗液沖洗濾膜（每張濾膜每次沖洗量≤100ml，總沖洗量≤1000ml），將濾膜菌面朝上貼于對應(yīng)培養(yǎng)基平板培養(yǎng)。

4.1.2 供試品微生物計數(shù)

1.按方法適用性試驗確認(rèn)的條件制備供試液，選取適宜稀釋級，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平行平板，同時設(shè)置陰性對照。

2.接種、培養(yǎng)：同4.1.1中平皿法或薄膜過濾法操作，嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度與時間。

3.菌落計數(shù)：培養(yǎng)結(jié)束后，點計平板上生長的菌落數(shù)，需氧菌選取菌落數(shù)30-300cfu的平板，霉菌和酵母菌選取10-100cfu的平板計數(shù)；菌落蔓延成片的平板不宜計數(shù)，平行平板取平均值計算結(jié)果。

4.2 控制菌檢查法（以大腸埃希菌為例）

1.富集培養(yǎng)：取10ml供試液（或適宜稀釋級供試液）接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）中，36±1℃培養(yǎng)24-48小時，觀察培養(yǎng)基渾濁度。

2.分離培養(yǎng)：取上述富集液1ml，接種至麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板，用無菌L型玻璃棒涂布均勻，36±1℃培養(yǎng)24-48小時，觀察是否出現(xiàn)紅色、圓形、邊緣整齊的特征菌落。

3.鑒定：挑取疑似菌落接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，進行生化試驗（如靛基質(zhì)試驗、乳糖發(fā)酵試驗等），確認(rèn)是否為目標(biāo)控制菌。

4.對照設(shè)置：同時進行陰性對照（稀釋液替代供試液）和陽性對照（接種標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌菌株），陽性對照需檢出目標(biāo)菌，陰性對照無菌生長，實驗結(jié)果方有效。

 

5 結(jié)果判定與記錄

5.1 結(jié)果判定

1.微生物計數(shù)：根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果，按供試品稀釋倍數(shù)計算每克（ml、cm²）供試品中的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，結(jié)果需符合對應(yīng)產(chǎn)品的藥典限度要求。

2.控制菌檢查：陰性對照無菌生長、陽性對照檢出目標(biāo)菌，供試品未檢出指定控制菌，判定為合格；若檢出控制菌或?qū)φ赵囼灝惓＃柚匦虏蓸訌?fù)檢，復(fù)檢仍不合格則判定為不符合規(guī)定。

3.若實驗過程中出現(xiàn)菌落污染、數(shù)據(jù)異常等偏差，需立即開展偏差調(diào)查，分析原因并采取糾正措施，記錄調(diào)查過程與結(jié)果。

5.2 結(jié)果記錄

實驗記錄需及時、準(zhǔn)確、完整，內(nèi)容包括：樣品信息（名稱、批號、采樣時間、數(shù)量）、實驗日期、環(huán)境條件、培養(yǎng)基與菌種信息、操作步驟、稀釋級、菌落數(shù)、對照試驗結(jié)果、判定結(jié)論、實驗人員簽字等。記錄需長期保存，保存期限不少于5年，確保可追溯。

 

6 實驗后處理與注意事項

6.1 實驗后處理

1.用過的培養(yǎng)基、菌液、污染器材需經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘滅活處理后，再進行無害化處置，避免微生物擴散污染環(huán)境。

2.潔凈工作臺及實驗區(qū)域用適宜消毒劑擦拭消毒，開啟紫外燈消毒30分鐘，整理實驗器材與環(huán)境，做好清潔記錄。

6.2 注意事項

1.全程嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，接種、稀釋、過濾等環(huán)節(jié)避免手部、衣物直接接觸供試液與培養(yǎng)基，移液管、培養(yǎng)皿等無菌器材不得觸碰非無菌表面。

2.菌液接種體積不得超過供試液體積的1%，避免影響微生物生長環(huán)境。

3.培養(yǎng)過程中定期觀察菌落生長情況，避免菌落重疊、蔓延影響計數(shù)準(zhǔn)確性；霉菌培養(yǎng)需防止孢子擴散污染其他平板。

4.實驗所用試劑、菌種需妥善保管，有毒有害試劑單獨存放，標(biāo)準(zhǔn)菌種嚴(yán)格按生物安全要求管理，防止泄露與誤用。

5.實驗人員需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)，熟悉操作規(guī)程與藥典要求，具備微生物實驗操作資質(zhì)，定期參加能力驗證與技能考核。

 

7 附則

本規(guī)程自發(fā)布之日起實施，由質(zhì)量控制部門負(fù)責(zé)解釋與修訂；若2025年版藥典相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)更新，需及時同步修訂本規(guī)程，確保合規(guī)性。