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摘 要： 采用離子色譜法測(cè)定輔助生殖培養(yǎng)用液中銨離子的質(zhì)量濃度，并對(duì)測(cè)定結(jié)果的不確定度進(jìn)行分析。通過(guò)建立不確定度的數(shù)學(xué)模型，從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制、樣品溶液處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、測(cè)量重復(fù)性等方面進(jìn)行不確定度評(píng)定，分析影響測(cè)定結(jié)果的各不確定度分量。當(dāng)輔助生殖培養(yǎng)用液中銨離子質(zhì)量濃度為0.755 μg/mL時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.124 μg/mL（k=2）。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程中所引入的不確定度影響最大，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及樣品測(cè)量重復(fù)性所引入的不確定度，而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及樣品溶液的稀釋所引入的不確定度影響較小。

 

關(guān)鍵詞： 輔助生殖培養(yǎng)用液； 銨離子； 離子色譜法； 不確定度

 

近年來(lái)隨著三孩政策的放開以及部分地區(qū)將輔助生殖項(xiàng)目納入醫(yī)保等利好消息的影響，輔助生殖技術(shù)正在影響著越來(lái)越多的家庭[1?3]。輔助生殖技術(shù)會(huì)用到許多培養(yǎng)用液，如取卵液、精子冷凍液、受精液、囊胚培養(yǎng)液等[4]。為了給配子及受精卵提供適宜的生存及發(fā)育的環(huán)境，這些培養(yǎng)用液中會(huì)含有適宜濃度的氨基酸類物質(zhì)，這些氨基酸在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)自發(fā)進(jìn)行脫氨反應(yīng)，生成氨，最終以銨離子的形式存在于培養(yǎng)用液中[5?7]。已有研究表明，過(guò)量的銨離子會(huì)影響受精卵的正常發(fā)育，降低胚胎種植成功率[8?10]，因此，培養(yǎng)用液中銨離子質(zhì)量濃度必須控制在較低的水平。為準(zhǔn)確測(cè)定培養(yǎng)用液中的銨離子質(zhì)量濃度，YY/T 1852—2022《人類輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械　培養(yǎng)用液中銨離子的測(cè)定》規(guī)定了兩種測(cè)定銨離子質(zhì)量濃度的方法，其中離子色譜法為仲裁法。然而，由于各種客觀因素的影響，離子色譜法的測(cè)量結(jié)果會(huì)存在一定的不確定度[11?12]，因此，對(duì)離子色譜法測(cè)定輔助生殖培養(yǎng)用液中銨離子的不確定度進(jìn)行評(píng)定具有重要意義。通過(guò)對(duì)該方法的不確定度進(jìn)行評(píng)定，可以幫助分析結(jié)果誤差來(lái)源，進(jìn)而通過(guò)采取措施減小測(cè)量誤差。目前，國(guó)內(nèi)尚未有對(duì)離子色譜法測(cè)定輔助生殖培養(yǎng)用液中銨離子的不確定度進(jìn)行評(píng)定的相關(guān)報(bào)道，這就使得銨離子測(cè)定結(jié)果的完整可靠性受到影響。為了填補(bǔ)這一空白，筆者以精子冷凍液為例，參考JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和CNAS-GL006-2018《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》，對(duì)離子色譜法測(cè)定輔助生殖培養(yǎng)用液中銨離子的不確定度來(lái)源進(jìn)行評(píng)定。參考文獻(xiàn)[13?18]，分別從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制、樣品溶液處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、測(cè)量重復(fù)性等方面進(jìn)行不確定度評(píng)定，以評(píng)估試驗(yàn)過(guò)程中各因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，為培養(yǎng)用液中銨離子的準(zhǔn)確測(cè)定提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為藥監(jiān)部門對(duì)培養(yǎng)液類產(chǎn)品質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：940型，帶有電導(dǎo)率檢測(cè)器，瑞士萬(wàn)通中國(guó)有限公司。離心機(jī)：3K15型，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。離心超濾管：Amicon Ultra-4mL-30K型，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。銨離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg/mL，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.7%(k=2)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)為GSB 04-2833-2011，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。硝酸：色譜級(jí)，阿拉丁生化科技股份有限公司。樣品：精子冷凍液，批號(hào)為045579，某公司產(chǎn)品。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Metrosep C Supp 2分析柱(250 mm×4.0 mm，5.0 μm，瑞士萬(wàn)通中國(guó)有限公司)，Metrosep C Supp 2 Guard保護(hù)柱(5 mm×4 mm，5.0 μm，瑞士萬(wàn)通中國(guó)有限公司)；淋洗液：1.00 mmol/L硝酸溶液；流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：40 ℃；洗脫方式：等度洗脫。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制精密量取銨離子標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用純化水稀釋并定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的銨離子標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取銨離子標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用純化水稀釋并定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的銨離子標(biāo)準(zhǔn)中間液；分別取銨離子標(biāo)準(zhǔn)中間液0.03、0.15、0.3、0.6、1.0 mL，置于5只10 mL容量瓶中，用純化水定容至標(biāo)線，得到質(zhì)量濃度分別為0.03、0.15、0.3、0.6、1.0 μg/mL的銨離子系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。1.3.2 樣品溶液處理取樣品1 mL，加純化水稀釋定容至5 mL，然后用Amicon Ultra-4mL-30K型離心超濾管在10 000 r/min條件下離心10 min進(jìn)行脫蛋白處理，取處理后的濾液作為樣品溶液。1.3.3 樣品測(cè)定按照1.2儀器工作條件，分別測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)工作液及樣品溶液，以銨離子質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品溶液的色譜峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品溶液中銨離子的質(zhì)量濃度。

 

2 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測(cè)量方法，樣品中銨離子含量的數(shù)學(xué)模型見式(1)：

    （1）

式中：ρ——樣品中銨離子的質(zhì)量濃度，μg/mL；ρ0——樣品溶液中銨離子的質(zhì)量濃度，μg/mL；f——稀釋倍數(shù)。

 

3 不確定度來(lái)源分析

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)學(xué)模型分析，不確定度的來(lái)源主要包括以下方面：(1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρ)；(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S)；(3)樣品溶液處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)；(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)；(5)測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)。

4 不確定度評(píng)定

4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρ)

由銨離子標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)證書可知，銨離子的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.7%(k=2)，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S)

標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制過(guò)程分為銨離子標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、中間液配制及銨離子系列標(biāo)準(zhǔn)工作液配制兩部分，因此urel(S)包括銨離子標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、中間液配制配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S1)及銨離子系列標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S2)兩部分。

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液、中間液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S1)

標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制過(guò)程中，主要涵蓋了量取1 mL銨離子標(biāo)準(zhǔn)溶液所使用的1 mL移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S11)和10 mL容量瓶所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S12)。1 mL移液器所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S11)又包含了移液器體積允差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S11A)及實(shí)驗(yàn)室溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S11B)。查詢1 mL移液器的校準(zhǔn)證書可知，其最大體積允差為0.01 mL，按照矩形分布，k=，1 mL移液器體積允差所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(2)計(jì)算：

      （2）

式中：——使用量具的最大允差；V——量取銨離子標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)的使用體積，mL。量具校準(zhǔn)溫度為20 ℃，實(shí)驗(yàn)室溫度為22 ℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1，按照矩形分布，k=，因此，由實(shí)驗(yàn)室溫度變化所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(3)計(jì)算：

      （3）

式中：——溫度波動(dòng)引起的體積偏差；α——體積膨脹系數(shù)；ΔT——溫度波動(dòng)。因此，1 mL移液器所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

同理，10 mL容量瓶所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S12)又包含了容量瓶體積允差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S12A)及實(shí)驗(yàn)室溫度變化所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S12B)。所用10 mL容量瓶為A級(jí)，最大允差為±0.02 mL，按照上述計(jì)算方法，10 mL容量瓶所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定：

綜上，標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S2)銨離子系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制過(guò)程中使用了計(jì)量檢定合格的1 mL移液器、0.2 mL移液器及10 mL容量瓶，具體使用次數(shù)見表1。移液器和容量瓶因體積允差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度和溫度變化(同4.2.1，即校準(zhǔn)溫度為20 ℃，實(shí)驗(yàn)室溫度為22 ℃)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均遵循矩形分布規(guī)律，即k=，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1。綜合以上數(shù)據(jù)，銨離子系列標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S2)見表1。

表1   銨離子系列標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

Tab. 1   Relative standard uncertainty introduced in the preparation of ammonium ion series standard working solution

 

合成上述兩部分，銨離子系列標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S)為：

4.3 樣品溶液處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

樣品溶液處理過(guò)程中需使用1 mL移液器、5 mL容量瓶，其不確定度主要來(lái)源于體積允差及環(huán)境溫度變化。1 mL移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算方式同4.2.1，urel(X1)=0.005 78。5 mL容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X2)又包含了容量瓶體積允差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X2A)及實(shí)驗(yàn)室溫度變化所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X2B)。所用5 mL容量瓶為A級(jí)，最大允差為±0.02 mL，按矩形分布，k=，5 mL容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

綜上，樣品溶液處理過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)

銨離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，共配制了5種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，通過(guò)離子色譜儀分析得到不同質(zhì)量濃度所對(duì)應(yīng)的色譜峰面積，依據(jù)最小二乘法，以銨離子質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體信息見表2。

表2   標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合結(jié)果

Tab. 2   Results of standard curve fitting

 

根據(jù)測(cè)試結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(4)計(jì)算：

   （4）

其中，s(y)為標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按式（5）計(jì)算：

   （5）

式中：yi——第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液所對(duì)應(yīng)的色譜峰面積；a——標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程的斜率；b——標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程的截距；xi——第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，μg/mL；n——標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)試次數(shù)，n=15；p——樣品溶液的測(cè)試次數(shù)，p=6；——樣品溶液的平均質(zhì)量濃度，μg/mL；——標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度。將表2中數(shù)據(jù)帶入式(4)~(5)計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(L)=0.029 9。

4.5 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

對(duì)樣品溶液平行6次測(cè)定，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)評(píng)價(jià)，結(jié)果見表3。根據(jù)表3測(cè)定結(jié)果和公式(1)，可得樣品中銨離子質(zhì)量濃度ρ=0.151×5=0.755 μg/mL。

表3   樣品溶液測(cè)定結(jié)果

Tab. 3   Determination results of sample solution

 

測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(6)計(jì)算：

     （6）

式中：——單次測(cè)得的銨離子質(zhì)量濃度，μg/mL。由測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.6 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel

各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表4。

表4   各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

Tab. 4   Relative standard uncertainty of each component

 

由各分量合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.7 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

根據(jù)CNAS-GL006-2018《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》，對(duì)于95%的置信水平，包含因子k=2，樣品中銨離子含量ρ=0.755 μg/mL，則擴(kuò)展不確定度為：U=k×urel×ρ=0.124 μg/mL離子色譜法測(cè)定輔助生殖培養(yǎng)液中銨離子的結(jié)果表示為(0.755±0.124) μg/mL，k=2。

 

5 結(jié)語(yǔ)

對(duì)離子色譜法測(cè)定輔助生殖培養(yǎng)液中銨離子過(guò)程的不確定度來(lái)源進(jìn)行了具體分析。測(cè)試結(jié)果的不確定度來(lái)源主要有：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品溶液處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及測(cè)量重復(fù)性。分析了各個(gè)因素對(duì)不確定度的影響，數(shù)據(jù)表明，標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制過(guò)程引入的不確定度最大，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度，而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及樣品溶液處理引入的不確定度較小。在采用離子色譜法測(cè)定輔助生殖培養(yǎng)液中的銨離子含量過(guò)程中，需重點(diǎn)關(guān)注對(duì)測(cè)試結(jié)果不確定度影響較大的因素，采取必要的措施來(lái)減少測(cè)量結(jié)果的不確定度。例如，配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、中間液及系列標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)，選用合適的移液器及容量瓶，選擇適宜的標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量濃度范圍；離子色譜儀要定期計(jì)量、維護(hù)等等，這樣才有助于提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)為輔助生殖培養(yǎng)液的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

 

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14 黃海霞，廖子祎，王海波，等.液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定淡水鱸魚中3-氨基-2-唑酮的不確定度評(píng)定［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2025，34（1）： 129.
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15 李莉，王繼雙，王海燕.高效液相色譜法測(cè)定化妝品中補(bǔ)骨脂酚的不確定度評(píng)定［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（10）：114.
    LI Li，WANG Jishuang，WANG Haiyan. Uncertainty evaluation for determination of bakuchiol in cosmetics by high performance liquid chromatography［J］. Chemical Analysis and Meterage，2024，33（10）： 114.

16 余星，朱紅瑞，肖杰，等.高效液相色譜法測(cè)定蜜餞中七種色素組分含量的不確定度評(píng)定［J］.中國(guó)食品添加劑，2024，35（3）： 263.
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17 柯慶青，李詩(shī)言，周倩，等.同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚肉粉中五氯酚鈉的不確定度評(píng)定［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（7）：117.
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18 肖璇，周凌聿，陳春泉，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中5種卡因類麻醉劑及其代謝物的不確定度［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（3）：121.
    XIAO Xuan，ZHOU Lingyu，CHEN Chunquan，et al. Uncertainty evaluation for determination of 5 caine anesthetics and their metabolites in aquatic products by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chemical Analysis and Meterage，2024，33（3）： 121