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2025年版《中國藥典》無菌醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)規(guī)程

 

1 總則

1.1 檢驗(yàn)?zāi)康?/span>

本規(guī)程依據(jù)2025年版《中國藥典》四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”及《GB 14233.1-2022 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第1部分：化學(xué)分析方法》制定，旨在通過標(biāo)準(zhǔn)化操作檢測無菌醫(yī)療器械（直接/間接接觸人體體液、組織或血液循環(huán)系統(tǒng)）中殘留的細(xì)菌內(nèi)毒素，判定其是否符合安全限值要求，防范因內(nèi)毒素引發(fā)的發(fā)熱、炎癥等不良反應(yīng)，保障臨床使用安全性。

 

1.2 檢驗(yàn)原理

采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（Bacterial Endotoxin Test, BET），利用鱟試劑與革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素的特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)檢測。鱟試劑可被內(nèi)毒素激活凝血因子，形成凝膠或產(chǎn)生濁度、顯色變化，反應(yīng)強(qiáng)度與內(nèi)毒素含量呈相關(guān)性。需注意，鱟試劑可能與β-葡聚糖發(fā)生交叉反應(yīng)產(chǎn)生假陽性，若醫(yī)療器械及浸提液含此類成分，應(yīng)選用去G因子鱟試劑或添加G因子反應(yīng)抑制劑排除干擾。

 

1.3 適用范圍

本規(guī)程適用于各類無菌醫(yī)療器械的細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)，包括但不限于：一次性使用注射器、輸液器、導(dǎo)管、植入式骨科器械、血液凈化裝置配件、外科侵入性器械等。按接觸人體方式分為高風(fēng)險(xiǎn)（直接入血、鞘內(nèi)接觸）、中風(fēng)險(xiǎn)（黏膜接觸）、低風(fēng)險(xiǎn)（皮膚破損接觸）三類，不同風(fēng)險(xiǎn)等級器械的限值設(shè)定與檢驗(yàn)要求需差異化執(zhí)行。

 

1.4 核心定義與單位

細(xì)菌內(nèi)毒素的量以“內(nèi)毒素單位（EU）”表示，1EU與1個(gè)內(nèi)毒素國際單位（IU）相當(dāng)。鱟試劑靈敏度以EU/ml表示，指規(guī)定條件下能使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)的最低內(nèi)毒素濃度。無菌醫(yī)療器械內(nèi)毒素限值通常以“EU/件”“EU/g”或“EU/cm²”表示，具體依據(jù)器械類型與接觸特性確定。

 

2 試驗(yàn)材料與器具要求

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品

•細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品：自大腸埃希菌提取精制，經(jīng)國際標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定效價(jià)，用于鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備等核心試驗(yàn)，復(fù)溶后需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用。

•細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：以國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價(jià)，適用于常規(guī)檢驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備，使用前需按說明書要求用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶，旋渦混合器混勻15分鐘確保溶解充分。

 

2.2 試劑

•鱟試劑：選用凝膠法或光度法專用凍干試劑（適配醫(yī)療器械浸提液檢測），新批號試劑使用前必須進(jìn)行靈敏度復(fù)核，確保無批次間差異影響結(jié)果。

•細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）：符合滅菌注射用水標(biāo)準(zhǔn)，凝膠法用BET水內(nèi)毒素含量≤0.015EU/ml，光度法用≤0.005EU/ml，且對試驗(yàn)無干擾，全程用于試劑復(fù)溶、器械浸提及稀釋。

•輔助試劑：調(diào)節(jié)浸提液pH值的無內(nèi)毒素酸、堿溶液或緩沖液（如磷酸鹽緩沖液），需以BET水在無內(nèi)毒素容器中配制，經(jīng)驗(yàn)證無內(nèi)毒素及干擾因子。

 

2.3 器具與儀器

•器具：耐熱器皿（玻璃試管、燒杯、浸提容器）需經(jīng)250℃干熱滅菌至少30分鐘（或180℃滅菌2小時(shí)）去除內(nèi)毒素；塑料器具（吸頭、微孔板、移液管）需選用標(biāo)明“無內(nèi)毒素、無干擾”的規(guī)格，禁止重復(fù)使用一次性無內(nèi)毒素器具。

•儀器：內(nèi)毒素凝膠法測定儀、恒溫器（精度±1℃，控溫37℃±1℃）、移液器（量程覆蓋0.1-10ml，定期校準(zhǔn)）、旋渦混合器、計(jì)時(shí)器，所有儀器使用前后需用BET水清潔，避免交叉污染。

 

3 試驗(yàn)前準(zhǔn)備

3.1 內(nèi)毒素限值（L）確定

根據(jù)醫(yī)療器械接觸人體方式、接觸時(shí)間及風(fēng)險(xiǎn)等級，按以下原則確定限值，高風(fēng)險(xiǎn)器械需嚴(yán)格遵循強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，中低風(fēng)險(xiǎn)器械可結(jié)合生物相容性試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整，但需提供驗(yàn)證依據(jù)：

 

3.1.1 計(jì)算公式

基礎(chǔ)公式：L = K/M，適配直接入血類器械；非入血類器械參考GB/T 16886.11按接觸面積、重量折算。

式中：

•K：人每千克體重每小時(shí)最大可接受內(nèi)毒素劑量，直接入血器械K=5EU/(kg·h)，鞘內(nèi)接觸器械K=0.2EU/(kg·h)，按體表面積給藥適配器械K=100EU/(m²·h)；

•M：人用每千克體重每小時(shí)最大器械接觸劑量，按器械容量、接觸面積折算，人均體重按60kg、體表面積按1.62m²計(jì)算。

 

3.1.2 典型器械限值示例

•一次性使用注射器（直接入血）：≤0.5EU/件；

•植入式骨科器械：≤0.06EU/g；

•外科侵入性手術(shù)刀（皮膚破損接觸）：≤20EU/件（需配套生物相容性驗(yàn)證）。

 

3.2 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）計(jì)算

MVD指醫(yī)療器械浸提液允許的最大稀釋倍數(shù)，確保稀釋后仍能檢測到設(shè)定限值，公式如下：

MVD = L×c/λ

式中：

•c：浸提液濃度（L以EU/件表示時(shí)，c為1件器械對應(yīng)的浸提液體積ml/件；L以EU/g表示時(shí)，c為器械重量g/ml）；

•λ：凝膠法鱟試劑標(biāo)示靈敏度（EU/ml），或光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度。

 

3.3 供試品（器械浸提液）制備

根據(jù)器械材質(zhì)（金屬、塑料、橡膠等）及結(jié)構(gòu)，采用適宜浸提方法制備供試品溶液，確保內(nèi)毒素充分溶出且不破壞其活性：

•浸提條件：取代表性樣品（批量≤1000件取3件，批量＞1000件取5件），剪碎（非密封型器械）或完整浸泡（密封型器械）于預(yù)熱至37℃±1℃的BET水中，液固比按器械表面積（1cm²:1ml）或重量（1g:10ml）設(shè)定，浸提時(shí)間為60分鐘±5分鐘，期間避免振動(dòng)。

•后續(xù)處理：浸提完成后靜置冷卻至室溫，取上清液作為供試品溶液，必要時(shí)用輔助試劑調(diào)節(jié)pH至6.0-8.0（適配鱟試劑反應(yīng)范圍），按計(jì)算的MVD進(jìn)行稀釋，每步稀釋在旋渦混合器上混勻30秒，稀釋倍數(shù)不超過10倍。

•特殊材質(zhì)：橡膠、塑料類器械浸提液若含析出物，需經(jīng)無內(nèi)毒素濾膜（孔徑0.22μm，驗(yàn)證無內(nèi)毒素吸附）過濾后檢測，避免雜質(zhì)干擾反應(yīng)。

 

4 檢驗(yàn)方法與操作流程

無菌醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)可采用凝膠檢測技術(shù)（方法1：凝膠限度法、方法2：凝膠定量法）或光度檢測技術(shù)（方法3：動(dòng)態(tài)濁度法、方法4：終點(diǎn)濁度法、方法5：動(dòng)態(tài)顯色法、方法6：終點(diǎn)顯色法）。常規(guī)檢驗(yàn)優(yōu)先采用凝膠限度法，結(jié)果有爭議時(shí)以凝膠限度法為準(zhǔn)；定量需求時(shí)選用光度法，需提前完成方法學(xué)驗(yàn)證。

 

4.1 凝膠限度法（方法1）

4.1.1 預(yù)備試驗(yàn)

包括鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)和供試品（浸提液）干擾試驗(yàn)，兩項(xiàng)試驗(yàn)均合格后方可開展正式檢驗(yàn)。

•鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：① 制備2λ、λ、0.5λ、0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋步旋渦混勻30秒，標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后混勻15分鐘；② 取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與等體積鱟試劑混合（每濃度平行4管），另設(shè)2管BET水為陰性對照；③ 封閉管口，垂直放入37℃±1℃恒溫器保溫60分鐘±2分鐘，全程避免振動(dòng)；④ 結(jié)果判斷：2λ管全陽性、0.25λ管全陰性、陰性對照全陰性為試驗(yàn)有效，計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值λc，λc在0.5~2λ范圍內(nèi)時(shí)，該批鱟試劑可使用。

•干擾試驗(yàn)：① 制備4類溶液：A（供試品浸提液）、B（供試品浸提液+內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度2λ、λ、0.5λ、0.25λ）、C（BET水+內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，同B濃度）、D（BET水，陰性對照）；② 按靈敏度復(fù)核試驗(yàn)操作，溶液A及D全陰性、溶液C符合靈敏度要求、溶液B的λc在0.5~2λ范圍內(nèi)，即為無干擾；③ 若存在干擾，可通過提高浸提液稀釋倍數(shù)（不超過MVD）、過濾除雜等方法排除，排除后需重新驗(yàn)證，確保內(nèi)毒素回收率在50%-200%。

 

4.1.2 正式檢驗(yàn)

① 取供試品浸提液（不超過MVD稀釋度）與等體積鱟試劑混合，平行2管（供試品管A）；② 設(shè)供試品陽性對照（溶液B：供試品浸提液+2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行2管）、陽性對照（溶液C：BET水+2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行2管）、陰性對照（溶液D：BET水，平行2管）；③ 按預(yù)備試驗(yàn)條件保溫并判斷結(jié)果；④ 結(jié)果判定：供試品管A全陰性、其余對照管結(jié)果符合要求，判為合格；供試品管A全陽性，判為不合格；一陽一陰時(shí)需復(fù)試，復(fù)試供試品管設(shè)4支，全陰性為合格，否則不合格。

 

4.2 其他檢驗(yàn)方法要點(diǎn)

•凝膠定量法（方法2）：在凝膠限度法基礎(chǔ)上，通過系列濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液建立劑量-反應(yīng)關(guān)系，計(jì)算供試品浸提液內(nèi)毒素含量，操作中需嚴(yán)格控制浸提液稀釋精度與保溫穩(wěn)定性，確保定量結(jié)果準(zhǔn)確。

•光度法（方法3~6）：利用濁度變化或顯色產(chǎn)物吸光度值定量內(nèi)毒素，需制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（相關(guān)系數(shù)≥0.98），同時(shí)驗(yàn)證線性范圍、低檢測限（LLOD）及定量限（LLOQ），適配醫(yī)療器械低濃度內(nèi)毒素檢測場景。

 

5 結(jié)果判斷與記錄

 

5.1 結(jié)果判斷

•限度檢驗(yàn)：供試品管全陰性、對照管結(jié)果符合要求，判為供試品細(xì)菌內(nèi)毒素合格；供試品管陽性，復(fù)試仍陽性，判為不合格。

•定量檢驗(yàn)：供試品內(nèi)毒素含量≤設(shè)定限值L，判為合格；超過L，判為不合格。

•異常處理：若對照管結(jié)果不符合要求，試驗(yàn)無效，需排查試劑、器具、操作流程等因素，重新進(jìn)行檢驗(yàn)并記錄偏差原因。

 

5.2 試驗(yàn)記錄

需詳細(xì)記錄以下信息，確?？勺匪菪裕孩?供試品信息（器械名稱、型號、批號、生產(chǎn)廠家、取樣數(shù)量、材質(zhì)）；② 試驗(yàn)材料信息（鱟試劑批號、靈敏度，標(biāo)準(zhǔn)品批號、效價(jià)，BET水批號及內(nèi)毒素含量）；③ 浸提條件（液固比、溫度、時(shí)間、pH值）；④ 預(yù)備試驗(yàn)與正式試驗(yàn)的全部數(shù)據(jù)、結(jié)果判斷過程；⑤ 儀器型號、校準(zhǔn)狀態(tài)及操作人員、試驗(yàn)日期；⑥ 異常情況及處理措施、復(fù)試結(jié)果。

 

6 注意事項(xiàng)與質(zhì)量控制

6.1 試驗(yàn)環(huán)境控制

試驗(yàn)需在潔凈度≥10000級、局部潔凈度≥100級的實(shí)驗(yàn)室開展，環(huán)境溫度控制在20-25℃，濕度45%-65%，避免灰塵、微生物污染；操作人員需穿戴無菌防護(hù)服、手套、口罩，手部避免直接接觸器具內(nèi)壁及供試品。

 

6.2 污染防控

所有器具需單獨(dú)存放于無內(nèi)毒素區(qū)域，避免與非無菌器具接觸；試驗(yàn)過程中每步操作需快速準(zhǔn)確，減少供試品暴露時(shí)間；BET水及試劑開啟后需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用，剩余部分密封冷藏，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

 

6.3 方法學(xué)驗(yàn)證要求

新類型醫(yī)療器械建立檢驗(yàn)方法時(shí)，需完成干擾試驗(yàn)、精密度、準(zhǔn)確度驗(yàn)證；當(dāng)器械材質(zhì)、生產(chǎn)工藝、鱟試劑批號變更，或試驗(yàn)環(huán)境發(fā)生可能影響結(jié)果的變化時(shí)，需重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)，確保方法適用性。

 

6.4 廢棄物處理

試驗(yàn)后含內(nèi)毒素的器具、廢液需經(jīng)高壓滅菌（121℃，30分鐘）或消毒處理后，再按醫(yī)療廢棄物管理規(guī)定處置，防止內(nèi)毒素?cái)U(kuò)散污染環(huán)境及后續(xù)試驗(yàn)。

 

7 附則

本規(guī)程未盡事宜，需嚴(yán)格遵循2025年版《中國藥典》四部通則1143、GB 14233.1-2022及GB/T 16886.11相關(guān)規(guī)定；本規(guī)程由質(zhì)量檢驗(yàn)部門負(fù)責(zé)解釋，每年結(jié)合藥典更新及器械檢驗(yàn)需求修訂一次。