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嘉峪檢測網(wǎng) 2026-03-15 14:16
摘要
目的：建立新的鹽酸普萘洛爾有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜分析方法，對《中華人民共和國藥典》2020年版（二部）鹽酸普萘洛爾原料藥及片劑質(zhì)量標準中有關(guān)物質(zhì)檢查方法進行改良，并對藥品質(zhì)量進行評價。
方法：采用新型堿性色譜系統(tǒng)替代混合離子對方法，選擇CERI色譜柱L-column3C18，（250mm×4.6mm，5μm），篩選優(yōu)化了緩沖液pH和有機相比例，在更為靈敏的230nm波長進行檢測，對新建方法進行方法學驗證，并開展雜質(zhì)分析，以及未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確定。
結(jié)果：該方法不僅可對3種已知雜質(zhì)（雜質(zhì)A、B、C）進行有效分離，還解決了藥典方法中α-萘酚峰與鹽酸普萘洛爾峰重合的問題。在部分樣品中發(fā)現(xiàn)的一較大的未知雜質(zhì)，經(jīng)分析確證并綜合結(jié)構(gòu)和合成工藝，確定該物質(zhì)為鹽酸普萘洛爾的β-同分異構(gòu)體，是鹽酸普萘洛爾的合成底物α-萘酚中混有β-萘酚而產(chǎn)生的合成副產(chǎn)物，目前各國藥典所采用的方法均不能檢出此雜質(zhì)。
結(jié)論：所建方法靈敏度高，專屬性強，操作簡便，實驗結(jié)果準確可靠，能有效地測定鹽酸普萘洛爾及其制劑中有關(guān)物質(zhì)組成和含量，為該系列質(zhì)量標準的修訂提供數(shù)據(jù)參考。
關(guān)鍵詞
高效液相色譜法；鹽酸普萘洛爾；有關(guān)物質(zhì)；β-同分異構(gòu)體；質(zhì)量評價
鹽酸普萘洛爾（propranolol hydrochloride），也稱心得安，為非選擇性β-受體拮抗劑，通過減弱或防止β受體興奮而使心臟的收縮力與收縮速度下降[1]，從而使心臟對運動或應(yīng)激的反應(yīng)減弱[2]。鹽酸普萘洛爾屬于OTC藥物，因其藥效確定、副作用小、價格較低，故在臨床使用較為廣泛。臨床主要用于高血壓[3]、心絞痛和心律失常等疾病的治療[4-5]。1962年由英國帝國化學工業(yè)集團公司Crowther等制得，我國自1968年已生產(chǎn)此品種，《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）從1977年版開始均收載了此品種。經(jīng)查詢藥監(jiān)局數(shù)據(jù)庫，鹽酸普萘洛爾原料藥有4個批準文號，4個生產(chǎn)企業(yè)；鹽酸普萘洛爾片有71個批準文號，71個生產(chǎn)企業(yè)，規(guī)格均為10mg。
鹽酸普萘洛爾原料藥和片劑質(zhì)量標準收載于《中國藥典》2020年版（ChP2020）[6]，英國藥典2020/歐洲藥典10.0（BP2020/EP10.0）[7-8]、美國藥典43（USP43）[9]和日本藥典（JP17）[10]也均有收載。其中ChP2020、BP2020/EP10.0、USP43和JP17均采用液相色譜法檢查鹽酸普萘洛爾原料藥有關(guān)物質(zhì)，色譜條件相同。ChP2020標準中有關(guān)物質(zhì)采用主成分自身對照法，未對已知雜質(zhì)進行單獨控制，JP17標準與ChP2020限度控制基本相同，而BP2020/EP10.0采用主成分自身對照法，USP43采用加校正因子的主成分外標法，對已知雜質(zhì)A、B、C進行單獨控制。各國藥典只有BP2020/EP10.0收載的鹽酸普萘洛爾片標準中設(shè)定了有關(guān)物質(zhì)檢查項，測定方法與原料藥相同。
鹽酸普萘洛爾上市較早，各國藥典均采用復雜的混合離子對色譜法檢查有關(guān)物質(zhì)，實測發(fā)現(xiàn)上述方法的峰形和柱效均不理想，且292nm的檢測波長靈敏度十分有限，此外上述方法所采用的流動相中含有性質(zhì)相反的離子對試劑（十二烷基硫酸鈉和四丁基磷酸二氫銨），離子對試劑的加入導致色譜系統(tǒng)平衡所需時間延長，色譜柱的損耗加大。我國ChP2020[6]標準中未考察本品的雜質(zhì)組成和含量，本文在該標準基礎(chǔ)上，對有關(guān)物質(zhì)檢查方法進行了改進，改變了色譜條件，采用新型堿性色譜柱系統(tǒng)替代混合離子對方法，優(yōu)化了有關(guān)物質(zhì)檢測波長，篩選了合適的色譜柱并進行方法學驗證。同時，對在部分樣品中發(fā)現(xiàn)的較大的未知雜質(zhì)進行了分析確證，并綜合結(jié)構(gòu)和合成工藝分析該物質(zhì)的可能來源。
根據(jù)《仿制藥參比制劑目錄（第五批）》[11]，鹽酸普萘洛爾片的參比制劑為阿斯利康株式會社鹽酸普萘洛爾片，因此應(yīng)用此方法，分別對國內(nèi)3家企業(yè)鹽酸普萘洛爾原料藥，3家企業(yè)鹽酸普萘洛爾片仿制藥以及參比制劑進行考察，對產(chǎn)品質(zhì)量進行評價。
1 儀器、試劑與試藥
島津20A高效液相色譜儀（Shimadzu公司，LC20AB泵，SIL-20ACHT自動進樣器，SPD-M20A二極管陣列檢測器，CTO-20AC柱溫箱，Shimadzu LC Solution工作站），Milli-Q純水機（Merck Millipore公司），電子天平（Sartorius公司）。Agela Technologies C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱、CERI L-Column3C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱（北京譜之道科技有限公司提供）、TOSOH TSK gel ODS-80TS C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱、Waters XBridgeTM C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱。醋酸銨（國藥集團化學試劑有限公司，批號1000128），氨水（國藥集團化學試劑有限公司，批號10002118）。乙腈為色譜純，實驗用水（超純水，實驗室自制），其他試劑均為分析純。
鹽酸普萘洛爾對照品[中國食品藥品檢定研究院（中檢院），批號100783-201202，100%，供溶出度檢查用]；鹽酸普萘洛爾對照品（USP，批號R031H0，99.9%）；雜質(zhì)A對照品（批號22-FEB-19-01，97.94%）、雜質(zhì)B對照品（批號30-JAN-19-02，98.12%），雜質(zhì)C對照品（批號10-MAR-19-03，99.39%）均來自QCC-USA；α-萘酚（中檢院，批號101216-201401，100%）。鹽酸普萘洛爾原料藥共3批（企業(yè)1~3）；鹽酸普萘洛爾片仿制藥3批（企業(yè)4~6），鹽酸普萘洛爾片參比制劑1批（阿斯利康株式會社）。
2 方法與結(jié)果
2.1 鹽酸普萘洛爾的有關(guān)物質(zhì)分析
經(jīng)過對國內(nèi)企業(yè)鹽酸普萘洛爾原料藥化學反應(yīng)過程及工藝流程的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)企業(yè)起始物料、合成路線基本一致，起始物料均為α-萘酚（甲萘酚），即現(xiàn)行標準中檢查的游離萘酚，合成主要步驟為醚化、胺化和成鹽，因而雜質(zhì)差異不大，所用輔料均為常見的片劑輔料，因此在合成過程中可能存在副產(chǎn)物的產(chǎn)生。此外，鹽酸普萘洛爾片生產(chǎn)企業(yè)的處方略有不同，但加工工藝基本一致，采用常用的制粒壓片法。
BP2020/EP10.0[7-8]和USP43[9]收錄的已知有關(guān)物質(zhì)主要包括雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C，均來源于合成副產(chǎn)物，ChP2020檢查的游離萘酚，為合成本品的起始物，見表1。
2.2 現(xiàn)行標準方法檢驗
ChP2020、BP2020/EP10.0、USP43和JP17采用液相色譜法檢查本品有關(guān)物質(zhì)，色譜條件相同。分別稱取鹽酸普萘洛爾對照品（中檢院）、雜質(zhì)A、B、C和α-萘酚對照品，用乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋制成約含主成分1mg·mL-1，已知雜質(zhì)均約為1μg·mL-1的混合對照品溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液（SST）。參照ChP2020有關(guān)物質(zhì)檢測方法，選擇Agela Technologies C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以乙腈-水-硫酸（55∶45∶0.1）的混合液（取十二烷基硫酸鈉1.6g和磷酸二氫四丁基銨0.31g溶于1000mL混合液中，用2mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH3.3）為流動相，檢測波長為292nm，進樣20μL。結(jié)果如圖1所示，混合對照品溶液中各組分峰形和柱效均不理想，α-萘酚峰與普萘洛爾峰幾乎重疊。
由于α-萘酚峰是鹽酸普萘洛爾在合成中使用的原料，嘗試調(diào)整有關(guān)物質(zhì)色譜條件，將主成分和各已知雜質(zhì)在同一色譜系統(tǒng)中實現(xiàn)分離。通過調(diào)整十二烷基硫酸鈉與磷酸二氫四丁基銨的濃度，以及換用庚烷硫酸鈉，均未能達到理想的分離效果，故對有關(guān)物質(zhì)測定色譜條件進行了重新研究，建立了不使用離子對試劑的堿性流動相色譜系統(tǒng)。
2.3 新建方法的色譜條件確定
2.3.1 流動相pH
經(jīng)軟件ChemDraw預測分析，鹽酸普萘洛爾的pKa為9.5（圖2），為兼顧主峰的峰形以及色譜柱的耐受性，采用醋酸銨為緩沖鹽，配制10mmol·L-1醋酸銨溶液，調(diào)節(jié)流動相中醋酸銨溶液的pH為10.0、10.5、11.0和11.3。為進一步提高雜質(zhì)分離度，改為梯度洗脫。
由表2可知，流動相中水相的pH對色譜峰的拖尾因子有影響，pH越低，拖尾因子越大。在該色譜條件下，主峰前發(fā)現(xiàn)一未知雜質(zhì)，與主峰相鄰，pH10和10.5時的主峰與相鄰雜質(zhì)不能達到基線分離，pH11.3時的分離度最優(yōu)，然而pH過高則對色譜柱的耐堿性要求更高，綜合評價pH11.0最優(yōu)。
2.3.2 流動相比例
為進一步提高雜質(zhì)分離度，色譜條件其他參數(shù)不變，僅改變梯度洗脫程序初始流動相的水相和有機相比例，分別設(shè)為醋酸銨溶液（10mmol·L-1醋酸銨溶液，用濃氨溶液調(diào)節(jié)pH至11.0）-乙腈（90∶10）-乙腈（67∶33）、（70∶30）和（73∶27）。由表3可知，當比例為73∶27時，主峰與相鄰峰分離度和拖尾因子最好，然而流動相中水相比例增加，主峰保留時間延長，處于梯度變化時間內(nèi)，有可能影響未知雜質(zhì)的檢出，綜合考慮流動相比例確定為70∶30。
2.3.3 色譜柱
優(yōu)化后色譜條件使4種已知雜質(zhì)和主成分均能有效分離，不同品牌色譜柱對色譜峰的分離度影響比較大，篩選具有高效分離而且耐堿性的色譜柱可能會提高分離度。分別選擇CERI L-Column3、TOSOH TSK gel ODS-80TS和Waters XBridgeTM的C18色譜柱，由表4可知，選擇的3種不同品牌相同規(guī)格的色譜柱除與主峰相鄰的未知雜質(zhì)之外，其他雜質(zhì)均能很好分離。TSK gel ODS-80TS和XBridgeTM色譜柱，均不能將主峰與該相鄰雜質(zhì)分離，而TSK gel色譜柱也延長了主峰的保留時間。經(jīng)過篩選，CERI的L-column3C18色譜柱能很好地分離相鄰雜質(zhì)和主峰。因此本方法只能選擇分離度高的耐堿性色譜柱，推薦CERI L-Column3色譜柱或效能相當?shù)纳V柱。
2.3.4 檢測波長
各國藥典標準檢測波長均選擇292nm，在上述流動相條件下采用PDA檢測器對SST中的鹽酸普萘洛爾、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B（顯示2個相連的色譜峰，為同分異構(gòu)體）、雜質(zhì)C、α-萘酚及與主成分的色譜峰相鄰未知雜質(zhì)在190~400nm范圍內(nèi)進行光譜掃描。由表5可知，上述化合物的最大吸收峰集中在213~230nm的范圍內(nèi)，292nm波長處的吸收均較弱，目標化合物在213~230nm的范圍內(nèi)的吸收度遠大于292nm處，綜合考慮梯度洗脫對基線的影響等因素，最終選擇230nm作為本方法的檢測波長。
2.4 色譜條件的確定
根據(jù)上述對色譜條件的探索，確定鹽酸普萘洛爾片的有關(guān)物質(zhì)的檢測方法如下：
色譜柱：CERI L-column3C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相A：醋酸銨溶液（10mmol·L-1醋酸銨溶液，用濃氨溶液調(diào)節(jié)pH至11.0）-乙腈（90∶10）；流動相B：乙腈；檢測波長：230nm；柱溫：30℃；流速：1.2mL·min-1；進樣體積：20μL；梯度洗脫程序見表6。
取“2.3”項下方法制備ST溶液，照色譜條件試驗，在230nm波長進行檢測，各已知雜質(zhì)和主峰相鄰未知雜質(zhì)均可以達到有效分離，見圖3。
2.5 與主成分色譜峰相鄰未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究與毒性預測
2.5.1 結(jié)構(gòu)研究
由于所建立的HPLC檢測方法采用了更靈敏的檢測波長，且具有更好的分離效率，使得在鹽酸普萘洛爾主峰前1個新未知雜質(zhì)被檢出，該雜質(zhì)在各國藥典中均未提及，但在中檢院提供的鹽酸普萘洛爾對照品以及部分樣品中有檢出，且為最大單個雜質(zhì)，如圖4所示，該未知雜質(zhì)的最大吸收波長為225nm，在292nm處幾乎沒有吸收，因此使用現(xiàn)行標準中292nm檢測波長未能檢出該雜質(zhì)。
采用上述液相色譜條件，通過質(zhì)譜檢測器對未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行了分析，其與鹽酸普萘洛爾的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜見圖5。通過LC-MS研究發(fā)現(xiàn)，該未知雜質(zhì)不僅與鹽酸普萘洛爾有相近的保留時間，其一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜也非常接近，僅二級質(zhì)譜的碎片離子豐度有一定差異，故推測其應(yīng)為鹽酸普萘洛爾的同分異構(gòu)體，且結(jié)構(gòu)相似。
結(jié)合紫外光譜信息和鹽酸普萘洛爾的合成工藝初步推測未知雜志結(jié)構(gòu)為側(cè)鏈接在萘環(huán)β位所形成異構(gòu)體見圖6，該雜質(zhì)來自合成原料α-萘酚中混入的β-萘酚的反應(yīng)產(chǎn)物。
依據(jù)上述推斷，進一步以β-萘酚為底物合成了β-同分異構(gòu)體，其在LC-MS上的保留時間和一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜信息上與未知有關(guān)物質(zhì)完全一致。進一步通過質(zhì)譜、核磁共振等方法對所合成的β-同分異構(gòu)體進行了結(jié)構(gòu)確證，所有結(jié)果與推測完全一致見圖7。依據(jù)鹽酸普萘洛爾的結(jié)構(gòu)和合成工藝分析，正常的合成和貯存過程產(chǎn)生β-位的異構(gòu)體可能性微乎其微，合成底物α-萘酚（鹽酸普萘洛爾的合成原料）中混有的β-萘酚應(yīng)為產(chǎn)生β-異構(gòu)體主要來源。
2.5.2 毒性預測
查閱相關(guān)資料，目前尚缺乏對未知雜質(zhì)β-同分異構(gòu)體藥理毒理研究資料，因此本研究使用Simulations Plus公司的ADMET Predictor計算軟件對該雜質(zhì)進行了毒性預測。預測結(jié)果顯示該雜質(zhì)口服急性毒性低，表現(xiàn)出一定的對梨形四膜蟲毒性，魚類毒性、蜜蜂毒性，無染色體變異性，不會產(chǎn)生致突變性，不會致癌，大鼠急性毒性低，無其他明顯毒性，在體內(nèi)不可降解。預測結(jié)果表明，該雜質(zhì)的毒性均較小，但仍需進一步進行藥理毒理性質(zhì)研究，該雜質(zhì)的存在具有一定的潛在風險，應(yīng)予以控制。
2.6 方法學驗證
2.6.1 耐用性試驗
取上述SST溶液，色譜條件其他參數(shù)不變，分別考察該方法在不同柱溫（27、30、35℃）、不同流速（1.1、1.2、1.3mL·min-1）、不同批次CERI L-Column3（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱的耐用性。
不同柱溫的影響：由表7可知，溫度在27~35℃范圍內(nèi)變化，色譜峰特性略有變化。溫度升高保留時間遷移，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度和理論板數(shù)也有所升高，雜質(zhì)B相鄰雙峰分離度略有下降，拖尾因子略有降低，綜合評判柱溫設(shè)置為30℃，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度滿足基線分離。
不同流速的影響：由表8可知，流速在1.1~1.3mL·min-1范圍內(nèi)變化，色譜峰特性略有改變，隨著流速增加，主峰保留時間縮短，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度和雜質(zhì)B相鄰雙峰分離度略降低，拖尾因子也隨著降低，綜合評判采用1.2mL·min-1流速。
不同批次色譜柱的影響：由表9可知，研究采用的CERI品牌不同批號色譜柱影響不大，均可以將β-同分異構(gòu)體與主峰基線分離。
2.6.2 專屬性試驗
取鹽酸普萘洛爾原料藥（來源企業(yè)2，批號171201）和鹽酸普萘洛爾片（來源企業(yè)6，批號190102），分別用乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋制成約含主成分1mg·mL-1供試品溶液，進行強制破壞性試驗。強制破壞試驗結(jié)果見圖8，鹽酸普萘洛爾原料藥在堿、高溫、光照和高濕下均比較穩(wěn)定，基本無降解產(chǎn)物出現(xiàn)，高濃度的堿破壞仍比較穩(wěn)定；氧化破壞下有顯著降解，主要降解產(chǎn)物為一未知雜質(zhì)和α-萘酚，保留時間分別為5.885min和8.569min，推測是由于強氧化導致羰基或氨基氧化，產(chǎn)生新的雜質(zhì)；在酸中有一定破壞，主要降解產(chǎn)物為α-萘酚，保留時間為8.875min，分析為強酸導致醚水解，產(chǎn)生α-萘酚。以上各種破壞條件下，降解產(chǎn)生的雜質(zhì)可以基本達到基線分離，能滿足有關(guān)物質(zhì)測定要求，確定的色譜條件可很好地分離有關(guān)物質(zhì)，鹽酸普萘洛爾片破壞試驗結(jié)果基本相同。
A. 正常比例（normal ratio） B. 放大比例（expanded）
圖8 強制破壞供試品溶液色譜圖
Fig.8 The chromatogram of the forced degradation of the test solution
2.6.3 重復性試驗
取鹽酸普萘洛爾原料藥（企業(yè)2，批號171201）和鹽酸普萘洛爾片（企業(yè)6，批號190102），用乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋制成約含主成分1mg·mL-1的供試品溶液，分別平行6份，比較鹽酸普萘洛爾雜質(zhì)峰面積變化情況。
（1）如表9所示，6份供試品均檢測出雜質(zhì)B，結(jié)果在0.026%~0.029%，其它已知雜質(zhì)均未檢出；6份樣品中其他未知最大雜質(zhì)含量在0.011%~0.018%，雜質(zhì)總量均小于0.1%，各雜質(zhì)含量基本一致，重復性良好，符合有關(guān)物質(zhì)精密度試驗要求。
（2）如表11所示，6份供試品均檢測出雜質(zhì)B，結(jié)果在0.028%~0.031%；均在主峰前發(fā)現(xiàn)β-異構(gòu)體峰，含量在0.326%~0.359%，其他已知雜質(zhì)A、B、α-萘酚均未檢出；6份樣品其他單個最大雜質(zhì)均在0.012%~0.018%。因為該樣品中檢出β-異構(gòu)體，雜質(zhì)總量在0.393%~0.427%，各雜質(zhì)含量基本一致，重復性良好，符合有關(guān)物質(zhì)精密度試驗要求。
2.6.4 溶液穩(wěn)定性試驗
取上述重復性試驗供試品溶液，分別在下述時間點進樣分析，記錄色譜圖，考察雜質(zhì)峰面積變化情況。
（1）如表12所示，0~48h內(nèi)不同時間點進樣鹽酸普萘洛爾原料藥供試品溶液均檢測出雜質(zhì)B，含量結(jié)果在0.027%~0.029%，其他已知雜質(zhì)均未檢出；其他單個最大雜質(zhì)含量在0.010%~0.028%，無新的雜質(zhì)檢出，雜質(zhì)峰面積之和雖略有變化，但是顯示和放置時間關(guān)系不大，雜質(zhì)總量未超過0.1%。結(jié)果表明，供試品溶液在48h內(nèi)可保持基本穩(wěn)定。
（2）如表12所示，不同進樣時間鹽酸普萘洛爾片供試品均檢測出雜質(zhì)B，結(jié)果在0.028%~0.031%；均在主峰前發(fā)現(xiàn)β-異構(gòu)體峰，含量在0.329%~0.337%，其他已知雜質(zhì)A、C及α-萘酚均未檢出，供試品溶液在48h內(nèi)可保持穩(wěn)定，沒有新的雜質(zhì)檢出，符合有關(guān)物質(zhì)試驗要求。
2.6.5 定量下限和檢測下限
取鹽酸普萘洛爾對照品（USP）和已知雜質(zhì)對照品各適量，分別用乙腈-水（50∶50）溶解并定量稀釋，精密量取20μL進樣，注入色譜儀，記錄色譜圖。當信噪比約為10∶1時測得鹽酸普萘洛爾定量限為4ng（0.2μg·mL-1），相對供試品濃度為0.02%；當信噪比約為3∶1時測得檢測限為2ng（0.1μg·mL-1），相對供試品濃度為0.01%，檢測限濃度約為對照品溶液濃度（1μg·mL-1）的1/10，靈敏度可滿足測定需求，其他已知雜質(zhì)的定量限和檢測限結(jié)果見表13。
2.7 樣品檢測
2.7.1 鹽酸普萘洛爾原料藥
采用擬定方法檢測3家企業(yè)提供的3批樣品，結(jié)果見表15和圖9，其中企業(yè)-2和企業(yè)-3的單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量均在0.1%以下，而企業(yè)-1由于含有β-異構(gòu)體，含量為0.347%，雜質(zhì)總量為0.389%。
2.7.2 鹽酸普萘洛爾片
采用擬定方法檢測參比制劑和3家仿制藥企業(yè)共4批樣品，結(jié)果見表16和圖10，其中參比制劑不含β-異構(gòu)體，雜質(zhì)總量僅為0.048%，仿制藥企業(yè)4不含β-異構(gòu)體，而仿制藥企業(yè)5和6均檢出β-異構(gòu)體，含量分別為0.023%和0.346%，仿制藥企業(yè)4和5單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量均低于0.1%和0.2%，而企業(yè)-6由于含有β-異構(gòu)體，雜質(zhì)總量為0.457%。
3 討論
3.1 新的有關(guān)物質(zhì)檢測方法的建立
目前，已報道測定鹽酸普萘洛爾的分析方法有色譜法、毛細管電泳法、電化學分析方法、光纖傳感分析技術(shù)等[12-14]。色譜法具有分離效果好、輔料無干擾、快速、簡便等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用在鹽酸普萘洛爾的檢測中[15-16]。各國現(xiàn)行版藥典均采用復雜的混合離子對色譜法檢查鹽酸普萘洛爾有關(guān)物質(zhì)，該方法存在的問題是，實測發(fā)現(xiàn)峰形和柱效均不理想，對普萘洛爾的結(jié)構(gòu)類似物（如α-萘酚、β-酚異構(gòu)體）不能有效分離，且292nm的檢測波長靈敏度十分有限。本探索研究建立了新的HPLC測定方法，用新型堿性色譜柱系統(tǒng)替代混合離子對方法，并采用更為靈敏的230nm波長進行檢測。該方法不僅對歐洲藥典收載的3種已知雜質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)A、B、C）可以有效分離，同時對普萘洛爾的結(jié)構(gòu)類似物具有更好的分析能力。并且本方法流動相水相的pH為11.0，因此需要選擇耐堿性比較強的色譜柱。通過篩選比較，CERI生產(chǎn)的L-column3C18色譜柱采用了獨特的氣態(tài)峰尾技術(shù)和新開發(fā)的PCS硅膠技術(shù)，穩(wěn)定性較好，適用的pH范圍為1~12，具有較高的耐堿性[17-18]。研究也證實該色譜柱的不同批次均表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性和耐受性，因此推薦操作中采用該色譜柱或效能相當?shù)纳V柱。
經(jīng)對不同生產(chǎn)企業(yè)原料藥和片劑樣品檢測以及同批次樣品在不同的保存條件下的樣品檢測結(jié)果進行分析，各特定雜質(zhì)、單個最大雜質(zhì)和雜質(zhì)總量均無顯著性差異，進一步表明本品有關(guān)物質(zhì)主要來自原料藥，與制劑生產(chǎn)工藝和保存條件關(guān)系不大，風險控制的重點應(yīng)控制原料藥。
3.2 β-異構(gòu)體研究
根據(jù)新建的有關(guān)物質(zhì)檢測方法，發(fā)現(xiàn)原料藥生產(chǎn)企業(yè)-1含有β-異構(gòu)體，而2家仿制藥生產(chǎn)企業(yè)5和6也檢出此雜質(zhì)。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，此2家仿制藥生產(chǎn)企業(yè)的原料藥來源均為原料藥生產(chǎn)企業(yè)-1，其中仿制藥生產(chǎn)企業(yè)-6和原料藥生產(chǎn)企業(yè)-1為同1批次，2者β-異構(gòu)體含量相似，表明該雜質(zhì)在制劑加工中未有變化，而仿制藥生產(chǎn)企業(yè)-5原料藥來源為不同批次，β-異構(gòu)體含量較低，表明該原料藥生產(chǎn)企業(yè)合成工藝不穩(wěn)定，導致各批原料間β-異構(gòu)體含量不一致。依據(jù)鹽酸普萘洛爾的結(jié)構(gòu)和合成工藝分析，正常的合成和貯存過程產(chǎn)生β-異構(gòu)體可能性微乎其微，在強制破壞性試驗中也未產(chǎn)生β-異構(gòu)體，因此推測合成底物α-萘酚（鹽酸普萘洛爾的合成原料）中混有的β-萘酚應(yīng)為產(chǎn)生β-異構(gòu)體主要來源。由于目前尚缺乏對β-異構(gòu)體藥理毒理研究資料，故應(yīng)對β-構(gòu)異構(gòu)體的潛在風險予以關(guān)注，并設(shè)法控制其限量，進一步研究β-異構(gòu)體性質(zhì)，制定更為科學的限度。根據(jù)新建的檢測方法，發(fā)現(xiàn)參比制劑檢測并無此雜質(zhì)，而國內(nèi)中檢院提供對照品以及部分樣品均含有此雜質(zhì)，應(yīng)在對照品制備和仿制藥評價中予以關(guān)注。此外，考慮到β-萘酚的反應(yīng)位阻較低，類似的情況在其他使用α酚萘酚作為合成底物的藥物中也可能存在，應(yīng)同樣加以重視，同時對作為原料藥合成底物的α-萘酚應(yīng)制定更為嚴格標準，從源頭上控制產(chǎn)生此類雜質(zhì)的潛在風險。
4 結(jié)論
本研究對鹽酸普萘洛爾原料藥和片劑現(xiàn)行標準中的有關(guān)物質(zhì)測定方法進行了考察及優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上建立的新方法靈敏度高，專屬性強，操作簡便，能將游離萘酚檢查納入有關(guān)物質(zhì)檢測中，并有效檢出現(xiàn)行標準未能檢出的β-異構(gòu)體，為《中國藥典》2020年版中鹽酸普萘洛爾質(zhì)量標準的修訂提供了參考。綜合結(jié)構(gòu)和合成工藝分析，推測該物質(zhì)為鹽酸普萘洛爾的β-異構(gòu)體，是鹽酸普萘洛爾的合成底物α-萘酚中混有β-萘酚而產(chǎn)生的合成副產(chǎn)物，由于該β異構(gòu)體藥理毒理性質(zhì)尚無相關(guān)詳細資料，該雜質(zhì)的存在具有一定的潛在風險。通過研究，還確認了鹽酸普萘洛爾高風險雜質(zhì)及質(zhì)量控制關(guān)鍵點，指導企業(yè)優(yōu)化相應(yīng)的生產(chǎn)工藝，提升產(chǎn)品質(zhì)量，為科學監(jiān)管提供技術(shù)保障和執(zhí)法依據(jù)，促進國產(chǎn)仿制藥質(zhì)量的不斷提高，為一致性評價工作提供有力的技術(shù)支撐。
來源：Internet
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