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摘要

目的：建立新的鹽酸普萘洛爾有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜分析方法，對(duì)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版（二部）鹽酸普萘洛爾原料藥及片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)檢查方法進(jìn)行改良，并對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

方法：采用新型堿性色譜系統(tǒng)替代混合離子對(duì)方法，選擇CERI色譜柱L-column3C18，（250mm×4.6mm，5μm），篩選優(yōu)化了緩沖液pH和有機(jī)相比例，在更為靈敏的230nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新建方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并開(kāi)展雜質(zhì)分析，以及未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確定。

結(jié)果：該方法不僅可對(duì)3種已知雜質(zhì)（雜質(zhì)A、B、C）進(jìn)行有效分離，還解決了藥典方法中α-萘酚峰與鹽酸普萘洛爾峰重合的問(wèn)題。在部分樣品中發(fā)現(xiàn)的一較大的未知雜質(zhì)，經(jīng)分析確證并綜合結(jié)構(gòu)和合成工藝，確定該物質(zhì)為鹽酸普萘洛爾的β-同分異構(gòu)體，是鹽酸普萘洛爾的合成底物α-萘酚中混有β-萘酚而產(chǎn)生的合成副產(chǎn)物，目前各國(guó)藥典所采用的方法均不能檢出此雜質(zhì)。

結(jié)論：所建方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能有效地測(cè)定鹽酸普萘洛爾及其制劑中有關(guān)物質(zhì)組成和含量，為該系列質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供數(shù)據(jù)參考。

 

關(guān)鍵詞

高效液相色譜法；鹽酸普萘洛爾；有關(guān)物質(zhì)；β-同分異構(gòu)體；質(zhì)量評(píng)價(jià)

 

鹽酸普萘洛爾（propranolol hydrochloride），也稱心得安，為非選擇性β-受體拮抗劑，通過(guò)減弱或防止β受體興奮而使心臟的收縮力與收縮速度下降[1]，從而使心臟對(duì)運(yùn)動(dòng)或應(yīng)激的反應(yīng)減弱[2]。鹽酸普萘洛爾屬于OTC藥物，因其藥效確定、副作用小、價(jià)格較低，故在臨床使用較為廣泛。臨床主要用于高血壓[3]、心絞痛和心律失常等疾病的治療[4-5]。1962年由英國(guó)帝國(guó)化學(xué)工業(yè)集團(tuán)公司Crowther等制得，我國(guó)自1968年已生產(chǎn)此品種，《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）從1977年版開(kāi)始均收載了此品種。經(jīng)查詢藥監(jiān)局?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，鹽酸普萘洛爾原料藥有4個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，4個(gè)生產(chǎn)企業(yè)；鹽酸普萘洛爾片有71個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，71個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，規(guī)格均為10mg。

鹽酸普萘洛爾原料藥和片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版（ChP2020）[6]，英國(guó)藥典2020/歐洲藥典10.0（BP2020/EP10.0）[7-8]、美國(guó)藥典43（USP43）[9]和日本藥典（JP17）[10]也均有收載。其中ChP2020、BP2020/EP10.0、USP43和JP17均采用液相色譜法檢查鹽酸普萘洛爾原料藥有關(guān)物質(zhì)，色譜條件相同。ChP2020標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)采用主成分自身對(duì)照法，未對(duì)已知雜質(zhì)進(jìn)行單獨(dú)控制，JP17標(biāo)準(zhǔn)與ChP2020限度控制基本相同，而B(niǎo)P2020/EP10.0采用主成分自身對(duì)照法，USP43采用加校正因子的主成分外標(biāo)法，對(duì)已知雜質(zhì)A、B、C進(jìn)行單獨(dú)控制。各國(guó)藥典只有BP2020/EP10.0收載的鹽酸普萘洛爾片標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)定了有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，測(cè)定方法與原料藥相同。

鹽酸普萘洛爾上市較早，各國(guó)藥典均采用復(fù)雜的混合離子對(duì)色譜法檢查有關(guān)物質(zhì)，實(shí)測(cè)發(fā)現(xiàn)上述方法的峰形和柱效均不理想，且292nm的檢測(cè)波長(zhǎng)靈敏度十分有限，此外上述方法所采用的流動(dòng)相中含有性質(zhì)相反的離子對(duì)試劑（十二烷基硫酸鈉和四丁基磷酸二氫銨），離子對(duì)試劑的加入導(dǎo)致色譜系統(tǒng)平衡所需時(shí)間延長(zhǎng)，色譜柱的損耗加大。我國(guó)ChP2020[6]標(biāo)準(zhǔn)中未考察本品的雜質(zhì)組成和含量，本文在該標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，對(duì)有關(guān)物質(zhì)檢查方法進(jìn)行了改進(jìn)，改變了色譜條件，采用新型堿性色譜柱系統(tǒng)替代混合離子對(duì)方法，優(yōu)化了有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)，篩選了合適的色譜柱并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。同時(shí)，對(duì)在部分樣品中發(fā)現(xiàn)的較大的未知雜質(zhì)進(jìn)行了分析確證，并綜合結(jié)構(gòu)和合成工藝分析該物質(zhì)的可能來(lái)源。

根據(jù)《仿制藥參比制劑目錄（第五批）》[11]，鹽酸普萘洛爾片的參比制劑為阿斯利康株式會(huì)社鹽酸普萘洛爾片，因此應(yīng)用此方法，分別對(duì)國(guó)內(nèi)3家企業(yè)鹽酸普萘洛爾原料藥，3家企業(yè)鹽酸普萘洛爾片仿制藥以及參比制劑進(jìn)行考察，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

 

1 儀器、試劑與試藥

島津20A高效液相色譜儀（Shimadzu公司，LC20AB泵，SIL-20ACHT自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，CTO-20AC柱溫箱，Shimadzu LC Solution工作站），Milli-Q純水機(jī)（Merck Millipore公司），電子天平（Sartorius公司）。Agela Technologies C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱、CERI L-Column3C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱（北京譜之道科技有限公司提供）、TOSOH TSK gel ODS-80TS C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱、Waters XBridgeTM C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱。醋酸銨（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)1000128），氨水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)10002118）。乙腈為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水（超純水，實(shí)驗(yàn)室自制），其他試劑均為分析純。

鹽酸普萘洛爾對(duì)照品[中國(guó)食品藥品檢定研究院（中檢院），批號(hào)100783-201202，100%，供溶出度檢查用]；鹽酸普萘洛爾對(duì)照品（USP，批號(hào)R031H0，99.9%）；雜質(zhì)A對(duì)照品（批號(hào)22-FEB-19-01，97.94%）、雜質(zhì)B對(duì)照品（批號(hào)30-JAN-19-02，98.12%），雜質(zhì)C對(duì)照品（批號(hào)10-MAR-19-03，99.39%）均來(lái)自QCC-USA；α-萘酚（中檢院，批號(hào)101216-201401，100%）。鹽酸普萘洛爾原料藥共3批（企業(yè)1~3）；鹽酸普萘洛爾片仿制藥3批（企業(yè)4~6），鹽酸普萘洛爾片參比制劑1批（阿斯利康株式會(huì)社）。

 

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸普萘洛爾的有關(guān)物質(zhì)分析

經(jīng)過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)企業(yè)鹽酸普萘洛爾原料藥化學(xué)反應(yīng)過(guò)程及工藝流程的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)企業(yè)起始物料、合成路線基本一致，起始物料均為α-萘酚（甲萘酚），即現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中檢查的游離萘酚，合成主要步驟為醚化、胺化和成鹽，因而雜質(zhì)差異不大，所用輔料均為常見(jiàn)的片劑輔料，因此在合成過(guò)程中可能存在副產(chǎn)物的產(chǎn)生。此外，鹽酸普萘洛爾片生產(chǎn)企業(yè)的處方略有不同，但加工工藝基本一致，采用常用的制粒壓片法。

BP2020/EP10.0[7-8]和USP43[9]收錄的已知有關(guān)物質(zhì)主要包括雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C，均來(lái)源于合成副產(chǎn)物，ChP2020檢查的游離萘酚，為合成本品的起始物，見(jiàn)表1。

2.2 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)

ChP2020、BP2020/EP10.0、USP43和JP17采用液相色譜法檢查本品有關(guān)物質(zhì)，色譜條件相同。分別稱取鹽酸普萘洛爾對(duì)照品（中檢院）、雜質(zhì)A、B、C和α-萘酚對(duì)照品，用乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋制成約含主成分1mg·mL-1，已知雜質(zhì)均約為1μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液（SST）。參照ChP2020有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，選擇Agela Technologies C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以乙腈-水-硫酸（55∶45∶0.1）的混合液（取十二烷基硫酸鈉1.6g和磷酸二氫四丁基銨0.31g溶于1000mL混合液中，用2mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH3.3）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為292nm，進(jìn)樣20μL。結(jié)果如圖1所示，混合對(duì)照品溶液中各組分峰形和柱效均不理想，α-萘酚峰與普萘洛爾峰幾乎重疊。

由于α-萘酚峰是鹽酸普萘洛爾在合成中使用的原料，嘗試調(diào)整有關(guān)物質(zhì)色譜條件，將主成分和各已知雜質(zhì)在同一色譜系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)分離。通過(guò)調(diào)整十二烷基硫酸鈉與磷酸二氫四丁基銨的濃度，以及換用庚烷硫酸鈉，均未能達(dá)到理想的分離效果，故對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定色譜條件進(jìn)行了重新研究，建立了不使用離子對(duì)試劑的堿性流動(dòng)相色譜系統(tǒng)。

2.3 新建方法的色譜條件確定

2.3.1 流動(dòng)相pH

經(jīng)軟件ChemDraw預(yù)測(cè)分析，鹽酸普萘洛爾的pKa為9.5（圖2），為兼顧主峰的峰形以及色譜柱的耐受性，采用醋酸銨為緩沖鹽，配制10mmol·L-1醋酸銨溶液，調(diào)節(jié)流動(dòng)相中醋酸銨溶液的pH為10.0、10.5、11.0和11.3。為進(jìn)一步提高雜質(zhì)分離度，改為梯度洗脫。

由表2可知，流動(dòng)相中水相的pH對(duì)色譜峰的拖尾因子有影響，pH越低，拖尾因子越大。在該色譜條件下，主峰前發(fā)現(xiàn)一未知雜質(zhì)，與主峰相鄰，pH10和10.5時(shí)的主峰與相鄰雜質(zhì)不能達(dá)到基線分離，pH11.3時(shí)的分離度最優(yōu)，然而pH過(guò)高則對(duì)色譜柱的耐堿性要求更高，綜合評(píng)價(jià)pH11.0最優(yōu)。

2.3.2 流動(dòng)相比例

為進(jìn)一步提高雜質(zhì)分離度，色譜條件其他參數(shù)不變，僅改變梯度洗脫程序初始流動(dòng)相的水相和有機(jī)相比例，分別設(shè)為醋酸銨溶液（10mmol·L-1醋酸銨溶液，用濃氨溶液調(diào)節(jié)pH至11.0）-乙腈（90∶10）-乙腈（67∶33）、（70∶30）和（73∶27）。由表3可知，當(dāng)比例為73∶27時(shí)，主峰與相鄰峰分離度和拖尾因子最好，然而流動(dòng)相中水相比例增加，主峰保留時(shí)間延長(zhǎng)，處于梯度變化時(shí)間內(nèi)，有可能影響未知雜質(zhì)的檢出，綜合考慮流動(dòng)相比例確定為70∶30。

2.3.3 色譜柱

優(yōu)化后色譜條件使4種已知雜質(zhì)和主成分均能有效分離，不同品牌色譜柱對(duì)色譜峰的分離度影響比較大，篩選具有高效分離而且耐堿性的色譜柱可能會(huì)提高分離度。分別選擇CERI L-Column3、TOSOH TSK gel ODS-80TS和Waters XBridgeTM的C18色譜柱，由表4可知，選擇的3種不同品牌相同規(guī)格的色譜柱除與主峰相鄰的未知雜質(zhì)之外，其他雜質(zhì)均能很好分離。TSK gel ODS-80TS和XBridgeTM色譜柱，均不能將主峰與該相鄰雜質(zhì)分離，而TSK gel色譜柱也延長(zhǎng)了主峰的保留時(shí)間。經(jīng)過(guò)篩選，CERI的L-column3C18色譜柱能很好地分離相鄰雜質(zhì)和主峰。因此本方法只能選擇分離度高的耐堿性色譜柱，推薦CERI L-Column3色譜柱或效能相當(dāng)?shù)纳V柱。

2.3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)

各國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)波長(zhǎng)均選擇292nm，在上述流動(dòng)相條件下采用PDA檢測(cè)器對(duì)SST中的鹽酸普萘洛爾、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B（顯示2個(gè)相連的色譜峰，為同分異構(gòu)體）、雜質(zhì)C、α-萘酚及與主成分的色譜峰相鄰未知雜質(zhì)在190~400nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。由表5可知，上述化合物的最大吸收峰集中在213~230nm的范圍內(nèi)，292nm波長(zhǎng)處的吸收均較弱，目標(biāo)化合物在213~230nm的范圍內(nèi)的吸收度遠(yuǎn)大于292nm處，綜合考慮梯度洗脫對(duì)基線的影響等因素，最終選擇230nm作為本方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 色譜條件的確定

根據(jù)上述對(duì)色譜條件的探索，確定鹽酸普萘洛爾片的有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法如下：

色譜柱：CERI L-column3C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A：醋酸銨溶液（10mmol·L-1醋酸銨溶液，用濃氨溶液調(diào)節(jié)pH至11.0）-乙腈（90∶10）；流動(dòng)相B：乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；柱溫：30℃；流速：1.2mL·min-1；進(jìn)樣體積：20μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表6。

取“2.3”項(xiàng)下方法制備ST溶液，照色譜條件試驗(yàn)，在230nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，各已知雜質(zhì)和主峰相鄰未知雜質(zhì)均可以達(dá)到有效分離，見(jiàn)圖3。

2.5 與主成分色譜峰相鄰未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究與毒性預(yù)測(cè)

2.5.1 結(jié)構(gòu)研究

由于所建立的HPLC檢測(cè)方法采用了更靈敏的檢測(cè)波長(zhǎng)，且具有更好的分離效率，使得在鹽酸普萘洛爾主峰前1個(gè)新未知雜質(zhì)被檢出，該雜質(zhì)在各國(guó)藥典中均未提及，但在中檢院提供的鹽酸普萘洛爾對(duì)照品以及部分樣品中有檢出，且為最大單個(gè)雜質(zhì)，如圖4所示，該未知雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為225nm，在292nm處幾乎沒(méi)有吸收，因此使用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中292nm檢測(cè)波長(zhǎng)未能檢出該雜質(zhì)。

采用上述液相色譜條件，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，其與鹽酸普萘洛爾的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜見(jiàn)圖5。通過(guò)LC-MS研究發(fā)現(xiàn)，該未知雜質(zhì)不僅與鹽酸普萘洛爾有相近的保留時(shí)間，其一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜也非常接近，僅二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子豐度有一定差異，故推測(cè)其應(yīng)為鹽酸普萘洛爾的同分異構(gòu)體，且結(jié)構(gòu)相似。

 

結(jié)合紫外光譜信息和鹽酸普萘洛爾的合成工藝初步推測(cè)未知雜志結(jié)構(gòu)為側(cè)鏈接在萘環(huán)β位所形成異構(gòu)體見(jiàn)圖6，該雜質(zhì)來(lái)自合成原料α-萘酚中混入的β-萘酚的反應(yīng)產(chǎn)物。

依據(jù)上述推斷，進(jìn)一步以β-萘酚為底物合成了β-同分異構(gòu)體，其在LC-MS上的保留時(shí)間和一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜信息上與未知有關(guān)物質(zhì)完全一致。進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜、核磁共振等方法對(duì)所合成的β-同分異構(gòu)體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，所有結(jié)果與推測(cè)完全一致見(jiàn)圖7。依據(jù)鹽酸普萘洛爾的結(jié)構(gòu)和合成工藝分析，正常的合成和貯存過(guò)程產(chǎn)生β-位的異構(gòu)體可能性微乎其微，合成底物α-萘酚（鹽酸普萘洛爾的合成原料）中混有的β-萘酚應(yīng)為產(chǎn)生β-異構(gòu)體主要來(lái)源。

 

2.5.2 毒性預(yù)測(cè)

查閱相關(guān)資料，目前尚缺乏對(duì)未知雜質(zhì)β-同分異構(gòu)體藥理毒理研究資料，因此本研究使用Simulations Plus公司的ADMET Predictor計(jì)算軟件對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行了毒性預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該雜質(zhì)口服急性毒性低，表現(xiàn)出一定的對(duì)梨形四膜蟲(chóng)毒性，魚(yú)類毒性、蜜蜂毒性，無(wú)染色體變異性，不會(huì)產(chǎn)生致突變性，不會(huì)致癌，大鼠急性毒性低，無(wú)其他明顯毒性，在體內(nèi)不可降解。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該雜質(zhì)的毒性均較小，但仍需進(jìn)一步進(jìn)行藥理毒理性質(zhì)研究，該雜質(zhì)的存在具有一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)予以控制。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 耐用性試驗(yàn)

取上述SST溶液，色譜條件其他參數(shù)不變，分別考察該方法在不同柱溫（27、30、35℃）、不同流速（1.1、1.2、1.3mL·min-1）、不同批次CERI L-Column3（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱的耐用性。

不同柱溫的影響：由表7可知，溫度在27~35℃范圍內(nèi)變化，色譜峰特性略有變化。溫度升高保留時(shí)間遷移，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度和理論板數(shù)也有所升高，雜質(zhì)B相鄰雙峰分離度略有下降，拖尾因子略有降低，綜合評(píng)判柱溫設(shè)置為30℃，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度滿足基線分離。

不同流速的影響：由表8可知，流速在1.1~1.3mL·min-1范圍內(nèi)變化，色譜峰特性略有改變，隨著流速增加，主峰保留時(shí)間縮短，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度和雜質(zhì)B相鄰雙峰分離度略降低，拖尾因子也隨著降低，綜合評(píng)判采用1.2mL·min-1流速。

不同批次色譜柱的影響：由表9可知，研究采用的CERI品牌不同批號(hào)色譜柱影響不大，均可以將β-同分異構(gòu)體與主峰基線分離。

2.6.2 專屬性試驗(yàn)

取鹽酸普萘洛爾原料藥（來(lái)源企業(yè)2，批號(hào)171201）和鹽酸普萘洛爾片（來(lái)源企業(yè)6，批號(hào)190102），分別用乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋制成約含主成分1mg·mL-1供試品溶液，進(jìn)行強(qiáng)制破壞性試驗(yàn)。強(qiáng)制破壞試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8，鹽酸普萘洛爾原料藥在堿、高溫、光照和高濕下均比較穩(wěn)定，基本無(wú)降解產(chǎn)物出現(xiàn)，高濃度的堿破壞仍比較穩(wěn)定；氧化破壞下有顯著降解，主要降解產(chǎn)物為一未知雜質(zhì)和α-萘酚，保留時(shí)間分別為5.885min和8.569min，推測(cè)是由于強(qiáng)氧化導(dǎo)致羰基或氨基氧化，產(chǎn)生新的雜質(zhì)；在酸中有一定破壞，主要降解產(chǎn)物為α-萘酚，保留時(shí)間為8.875min，分析為強(qiáng)酸導(dǎo)致醚水解，產(chǎn)生α-萘酚。以上各種破壞條件下，降解產(chǎn)生的雜質(zhì)可以基本達(dá)到基線分離，能滿足有關(guān)物質(zhì)測(cè)定要求，確定的色譜條件可很好地分離有關(guān)物質(zhì)，鹽酸普萘洛爾片破壞試驗(yàn)結(jié)果基本相同。

A. 正常比例（normal ratio）　B. 放大比例（expanded）

圖8　強(qiáng)制破壞供試品溶液色譜圖

Fig.8 The chromatogram of the forced degradation of the test solution

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取鹽酸普萘洛爾原料藥（企業(yè)2，批號(hào)171201）和鹽酸普萘洛爾片（企業(yè)6，批號(hào)190102），用乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋制成約含主成分1mg·mL-1的供試品溶液，分別平行6份，比較鹽酸普萘洛爾雜質(zhì)峰面積變化情況。

（1）如表9所示，6份供試品均檢測(cè)出雜質(zhì)B，結(jié)果在0.026%~0.029%，其它已知雜質(zhì)均未檢出；6份樣品中其他未知最大雜質(zhì)含量在0.011%~0.018%，雜質(zhì)總量均小于0.1%，各雜質(zhì)含量基本一致，重復(fù)性良好，符合有關(guān)物質(zhì)精密度試驗(yàn)要求。

（2）如表11所示，6份供試品均檢測(cè)出雜質(zhì)B，結(jié)果在0.028%~0.031%；均在主峰前發(fā)現(xiàn)β-異構(gòu)體峰，含量在0.326%~0.359%，其他已知雜質(zhì)A、B、α-萘酚均未檢出；6份樣品其他單個(gè)最大雜質(zhì)均在0.012%~0.018%。因?yàn)樵摌悠分袡z出β-異構(gòu)體，雜質(zhì)總量在0.393%~0.427%，各雜質(zhì)含量基本一致，重復(fù)性良好，符合有關(guān)物質(zhì)精密度試驗(yàn)要求。

2.6.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述重復(fù)性試驗(yàn)供試品溶液，分別在下述時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，考察雜質(zhì)峰面積變化情況。

（1）如表12所示，0~48h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣鹽酸普萘洛爾原料藥供試品溶液均檢測(cè)出雜質(zhì)B，含量結(jié)果在0.027%~0.029%，其他已知雜質(zhì)均未檢出；其他單個(gè)最大雜質(zhì)含量在0.010%~0.028%，無(wú)新的雜質(zhì)檢出，雜質(zhì)峰面積之和雖略有變化，但是顯示和放置時(shí)間關(guān)系不大，雜質(zhì)總量未超過(guò)0.1%。結(jié)果表明，供試品溶液在48h內(nèi)可保持基本穩(wěn)定。

（2）如表12所示，不同進(jìn)樣時(shí)間鹽酸普萘洛爾片供試品均檢測(cè)出雜質(zhì)B，結(jié)果在0.028%~0.031%；均在主峰前發(fā)現(xiàn)β-異構(gòu)體峰，含量在0.329%~0.337%，其他已知雜質(zhì)A、C及α-萘酚均未檢出，供試品溶液在48h內(nèi)可保持穩(wěn)定，沒(méi)有新的雜質(zhì)檢出，符合有關(guān)物質(zhì)試驗(yàn)要求。

2.6.5 定量下限和檢測(cè)下限

取鹽酸普萘洛爾對(duì)照品（USP）和已知雜質(zhì)對(duì)照品各適量，分別用乙腈-水（50∶50）溶解并定量稀釋，精密量取20μL進(jìn)樣，注入色譜儀，記錄色譜圖。當(dāng)信噪比約為10∶1時(shí)測(cè)得鹽酸普萘洛爾定量限為4ng（0.2μg·mL-1），相對(duì)供試品濃度為0.02%；當(dāng)信噪比約為3∶1時(shí)測(cè)得檢測(cè)限為2ng（0.1μg·mL-1），相對(duì)供試品濃度為0.01%，檢測(cè)限濃度約為對(duì)照品溶液濃度（1μg·mL-1）的1/10，靈敏度可滿足測(cè)定需求，其他已知雜質(zhì)的定量限和檢測(cè)限結(jié)果見(jiàn)表13。

2.7 樣品檢測(cè)

2.7.1 鹽酸普萘洛爾原料藥

采用擬定方法檢測(cè)3家企業(yè)提供的3批樣品，結(jié)果見(jiàn)表15和圖9，其中企業(yè)-2和企業(yè)-3的單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量均在0.1%以下，而企業(yè)-1由于含有β-異構(gòu)體，含量為0.347%，雜質(zhì)總量為0.389%。

2.7.2 鹽酸普萘洛爾片

采用擬定方法檢測(cè)參比制劑和3家仿制藥企業(yè)共4批樣品，結(jié)果見(jiàn)表16和圖10，其中參比制劑不含β-異構(gòu)體，雜質(zhì)總量?jī)H為0.048%，仿制藥企業(yè)4不含β-異構(gòu)體，而仿制藥企業(yè)5和6均檢出β-異構(gòu)體，含量分別為0.023%和0.346%，仿制藥企業(yè)4和5單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量均低于0.1%和0.2%，而企業(yè)-6由于含有β-異構(gòu)體，雜質(zhì)總量為0.457%。

 

3 討論

3.1 新的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的建立

目前，已報(bào)道測(cè)定鹽酸普萘洛爾的分析方法有色譜法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)分析方法、光纖傳感分析技術(shù)等[12-14]。色譜法具有分離效果好、輔料無(wú)干擾、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用在鹽酸普萘洛爾的檢測(cè)中[15-16]。各國(guó)現(xiàn)行版藥典均采用復(fù)雜的混合離子對(duì)色譜法檢查鹽酸普萘洛爾有關(guān)物質(zhì)，該方法存在的問(wèn)題是，實(shí)測(cè)發(fā)現(xiàn)峰形和柱效均不理想，對(duì)普萘洛爾的結(jié)構(gòu)類似物（如α-萘酚、β-酚異構(gòu)體）不能有效分離，且292nm的檢測(cè)波長(zhǎng)靈敏度十分有限。本探索研究建立了新的HPLC測(cè)定方法，用新型堿性色譜柱系統(tǒng)替代混合離子對(duì)方法，并采用更為靈敏的230nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。該方法不僅對(duì)歐洲藥典收載的3種已知雜質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)A、B、C）可以有效分離，同時(shí)對(duì)普萘洛爾的結(jié)構(gòu)類似物具有更好的分析能力。并且本方法流動(dòng)相水相的pH為11.0，因此需要選擇耐堿性比較強(qiáng)的色譜柱。通過(guò)篩選比較，CERI生產(chǎn)的L-column3C18色譜柱采用了獨(dú)特的氣態(tài)峰尾技術(shù)和新開(kāi)發(fā)的PCS硅膠技術(shù)，穩(wěn)定性較好，適用的pH范圍為1~12，具有較高的耐堿性[17-18]。研究也證實(shí)該色譜柱的不同批次均表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性和耐受性，因此推薦操作中采用該色譜柱或效能相當(dāng)?shù)纳V柱。

經(jīng)對(duì)不同生產(chǎn)企業(yè)原料藥和片劑樣品檢測(cè)以及同批次樣品在不同的保存條件下的樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，各特定雜質(zhì)、單個(gè)最大雜質(zhì)和雜質(zhì)總量均無(wú)顯著性差異，進(jìn)一步表明本品有關(guān)物質(zhì)主要來(lái)自原料藥，與制劑生產(chǎn)工藝和保存條件關(guān)系不大，風(fēng)險(xiǎn)控制的重點(diǎn)應(yīng)控制原料藥。

3.2 β-異構(gòu)體研究

根據(jù)新建的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)原料藥生產(chǎn)企業(yè)-1含有β-異構(gòu)體，而2家仿制藥生產(chǎn)企業(yè)5和6也檢出此雜質(zhì)。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，此2家仿制藥生產(chǎn)企業(yè)的原料藥來(lái)源均為原料藥生產(chǎn)企業(yè)-1，其中仿制藥生產(chǎn)企業(yè)-6和原料藥生產(chǎn)企業(yè)-1為同1批次，2者β-異構(gòu)體含量相似，表明該雜質(zhì)在制劑加工中未有變化，而仿制藥生產(chǎn)企業(yè)-5原料藥來(lái)源為不同批次，β-異構(gòu)體含量較低，表明該原料藥生產(chǎn)企業(yè)合成工藝不穩(wěn)定，導(dǎo)致各批原料間β-異構(gòu)體含量不一致。依據(jù)鹽酸普萘洛爾的結(jié)構(gòu)和合成工藝分析，正常的合成和貯存過(guò)程產(chǎn)生β-異構(gòu)體可能性微乎其微，在強(qiáng)制破壞性試驗(yàn)中也未產(chǎn)生β-異構(gòu)體，因此推測(cè)合成底物α-萘酚（鹽酸普萘洛爾的合成原料）中混有的β-萘酚應(yīng)為產(chǎn)生β-異構(gòu)體主要來(lái)源。由于目前尚缺乏對(duì)β-異構(gòu)體藥理毒理研究資料，故應(yīng)對(duì)β-構(gòu)異構(gòu)體的潛在風(fēng)險(xiǎn)予以關(guān)注，并設(shè)法控制其限量，進(jìn)一步研究β-異構(gòu)體性質(zhì)，制定更為科學(xué)的限度。根據(jù)新建的檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)參比制劑檢測(cè)并無(wú)此雜質(zhì)，而國(guó)內(nèi)中檢院提供對(duì)照品以及部分樣品均含有此雜質(zhì)，應(yīng)在對(duì)照品制備和仿制藥評(píng)價(jià)中予以關(guān)注。此外，考慮到β-萘酚的反應(yīng)位阻較低，類似的情況在其他使用α酚萘酚作為合成底物的藥物中也可能存在，應(yīng)同樣加以重視，同時(shí)對(duì)作為原料藥合成底物的α-萘酚應(yīng)制定更為嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，從源頭上控制產(chǎn)生此類雜質(zhì)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

 

4 結(jié)論

本研究對(duì)鹽酸普萘洛爾原料藥和片劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法進(jìn)行了考察及優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上建立的新方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，能將游離萘酚檢查納入有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)中，并有效檢出現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)未能檢出的β-異構(gòu)體，為《中國(guó)藥典》2020年版中鹽酸普萘洛爾質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了參考。綜合結(jié)構(gòu)和合成工藝分析，推測(cè)該物質(zhì)為鹽酸普萘洛爾的β-異構(gòu)體，是鹽酸普萘洛爾的合成底物α-萘酚中混有β-萘酚而產(chǎn)生的合成副產(chǎn)物，由于該β異構(gòu)體藥理毒理性質(zhì)尚無(wú)相關(guān)詳細(xì)資料，該雜質(zhì)的存在具有一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)研究，還確認(rèn)了鹽酸普萘洛爾高風(fēng)險(xiǎn)雜質(zhì)及質(zhì)量控制關(guān)鍵點(diǎn)，指導(dǎo)企業(yè)優(yōu)化相應(yīng)的生產(chǎn)工藝，提升產(chǎn)品質(zhì)量，為科學(xué)監(jiān)管提供技術(shù)保障和執(zhí)法依據(jù)，促進(jìn)國(guó)產(chǎn)仿制藥質(zhì)量的不斷提高，為一致性評(píng)價(jià)工作提供有力的技術(shù)支撐。