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摘 要： 建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器波長切換法同時測定尿素維E乳膏中尿素和維生素E含量。采用Inertsil ODS-SP C18色譜柱，以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，流量為1.0 mL/min，尿素檢測波長為195 nm，維生素E檢測波長為285 nm，柱溫為25 ℃；進樣體積為10 μL。尿素和維生素E的質(zhì)量濃度分別在121.0～1 209.6 μg/mL、8.2～81.5 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 4和0.999 9，檢出限分別為0.006、0.01 μg/mL，定量限分別為0.02、0.05 μg/mL。精密度試驗測定結(jié)果的相對標準偏差分別為0.80%、0.90%（n=6）。樣品加標平均回收率分別為101%和100%，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。該方法專屬性強、準確性好、簡便高效，可用于尿素維E乳膏的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標準改進提供參考。

 

關(guān)鍵詞： 尿素維E乳膏； 尿素； 維生素E； 波長切換法； 高效液相色譜-二極管陣列檢測器； 含量測定

 

尿素維E乳膏是一種由尿素與維生素E作為主要活性成分組成的復(fù)方制劑，呈乳劑型基質(zhì)乳白色軟膏，具有芳香氣味。每克制劑中含有尿素150 mg、維生素E 10 mg及相應(yīng)輔料，臨床主要用于治療手足皸裂[1]。尿素，又稱碳酰胺或脲，臨床上可用于角質(zhì)軟化，在其他領(lǐng)域也得到應(yīng)用[2?3]?！吨腥A人民共和國藥典》2025年版二部采用凱氏定氮法測定尿素含量[4]，該方法測定誤差大，操作繁瑣。維生素E抗氧化性較強，可清除自由基，阻斷脂質(zhì)氧化等[5?6]，《中華人民共和國藥典》2025年版二部[4]中收錄維生素E片等劑型的含量測定均采用氣相色譜法，相關(guān)文獻也采用氣相色譜法測定維生素E含量[7]。藥品中尿素和維生素E的檢測方法主要為高效液相色譜（HPLC）法[8-12]，因其具有簡單、快速檢測等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用。當前尿素維E乳膏的執(zhí)行標準為國家藥品標準WS-10001-(HD-0528)-2002，僅采用紫外分光度法法測定尿素含量，未提供維生素E含量測定方法。目前僅有文獻[13]建立HPLC法測定尿素維E軟膏中兩種主藥的含量，但該方法采用不同色譜柱和流動相分別測定尿素和維生素E的含量，配制過程繁瑣，檢測效率較低。筆者參考相關(guān)文獻[8-12]中尿素和維生素E的含量測定方法，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器波長切換法同時測定尿素維E乳膏中尿素和維生素E含量。該方法專屬性好、簡便高效，可用于尿素維E乳膏的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標準改進和提高提供依據(jù)和參考。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，配DAD檢測器，美國安捷倫科技有限公司。電子天平：Sartorius BP211D型，感量為0.000 1 g，德國賽多利斯公司。超聲波清洗器：B5500S-MT型，上海必能新超聲有限公司。恒溫水浴鍋：HH-24型，甘易儀器設(shè)備(上海)有限公司超純水機：Milli-Q IQ7000型，默克化工技術(shù)(上海)有限公司。尿素對照品：質(zhì)量分數(shù)為99.8%，批號為100288-202204，中國食品藥品檢定研究院。維生素E對照品：質(zhì)量分數(shù)為98.0%，批號為100062-201811，中國食品藥品檢定研究院。無水乙醇、甲醇、乙腈：均為色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。尿素維E乳膏：市售。實驗室用水均為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 µm，日本島津公司)；檢測器：二極管陣列檢測器；柱溫：25 ℃；流動相：A相為水，B相為甲醇；流量：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序和檢測波長見表1。

表1   梯度洗脫程序和檢測波長

Tab. 1   Gradient elution program and detection wavelength

 

1.3 溶液配制

混合對照品儲備液：稱取尿素對照品約48 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加入適量乙腈超聲使溶解，用乙腈稀釋至標線，搖勻，作為尿素對照品儲備液；稱取維生素E對照品約32 mg，精密稱定，置于20 mL容量瓶中，加入適量乙腈超聲使溶解，用乙腈稀釋至標線，搖勻，作為維生素E對照品儲備液；再分別精密量取尿素對照品儲備液5 mL和維生素E對照品儲備液1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加入乙腈稀釋至標線，搖勻，得到尿素和維生素E質(zhì)量濃度分別為2 400、160 μg/mL的混合對照品儲備液。混合對照品溶液：精密量取混合對照品儲備液5 mL，置于20 mL容量瓶中，加入乙腈稀釋至標線，搖勻，得到尿素和維生素E質(zhì)量濃度分別為600、40 μg/mL的混合對照品溶液。系列混合標準工作溶液：分別精密量取混合對照品儲備液50、100、250、400、500 μL，并用乙腈定容至1.0 mL，得到尿素質(zhì)量濃度分別為120、240、600、960、1 200 μg/mL，維生素E質(zhì)量濃度分別為8、16、40、64、80 μg/mL的系列混合標準工作溶液。

1.4 樣品處理

稱取尿素維E乳膏約0.1 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加乙腈適量，置于70 ℃水浴中加熱15 min，放冷至室溫，加乙腈稀釋至標線，搖勻，置于冰浴中冷卻30 min，取出溶液，迅速經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，放至室溫即得陽性樣品溶液。按照處方配制不含尿素和維生素E的空白乳膏基質(zhì)，按陽性樣品溶液配制方法來制備陰性樣品溶液。

1.5 樣品測定

在1.2儀器工作條件下，分別測定系列混合標準工作溶液和樣品溶液，記錄保留時間和色譜峰面積，以外標法計算樣品中尿素和維生素E質(zhì)量分數(shù)。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑選擇

尿素具有很強的極性，采用C18柱進樣時，其出峰時間較短，可能導(dǎo)致尿素峰和溶劑峰發(fā)生重疊，影響樣品含量測定，因此選擇不同的溶劑(甲醇、無水乙醇、乙腈)對其進行篩選，同時考察溶劑對維生素E的提取效果。甲醇、無水乙醇、乙腈作溶劑樣品溶液色譜圖如圖1所示。從圖1中可以看出，甲醇和無水乙醇產(chǎn)生的溶劑峰與尿素峰(保留時間約3.0 min)存在部分重疊，影響尿素積分和結(jié)果測定；而乙腈產(chǎn)生的溶劑峰與尿素峰完全分離，不產(chǎn)生干擾；同時乙腈作溶劑時，主成分的理論塔板數(shù)和拖尾因子均優(yōu)于甲醇和無水乙醇。在維生素E的提取效果方面，乙腈與無水乙醇的色譜峰面積接近，甲醇難以充分提取維生素E。綜合考慮，選擇乙腈作為樣品溶劑。

圖1   甲醇、無水乙醇、乙腈作溶劑時樣品溶液色譜圖

Fig. 1   Chromatographic diagram of sample solution with methanol，anhydrous ethanol and acetonitrile as solvents

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 檢測波長選擇

取尿素和維生素E對照溶液進行光譜掃描，掃描圖譜如圖2所示。從圖2中可以看出，尿素在190～200 nm范圍處呈現(xiàn)顯著的末端吸收。根據(jù)文獻[9,15]的研究方法，通常選擇195 nm作為尿素的特征檢測波長。文獻[14]報道選擇285 nm波長測定尿素維E軟膏中的維生素E，光譜掃描結(jié)果表明，維生素E在285、336、376、391 nm處有最大吸收，綜合考慮，選擇維生素E最佳檢測波長為285 nm。當采用單一波長進行同步檢測時，兩種分析物均無法獲得理想的響應(yīng)信號。為實現(xiàn)對尿素和維生素E的準確分析，采用波長切換法進行測定：首先在195 nm波長下檢測尿素組分，待其色譜峰完全出峰后，將檢測波長切換至285 nm以測定維生素E。該方法既能確保兩種成分獲得良好的檢測響應(yīng)，又可簡化分析流程，實現(xiàn)直觀的定量分析。

圖2   尿素和維生素E光譜掃描圖譜

Fig. 2   Spectral scanning spectra of urea and vitamin E

2.2.2 流動相選擇

文獻報道當流動相中含有甲醇、乙腈等有機溶劑時，尿素的保留時間過短，易受到輔料峰和溶劑峰的干擾，因此通常選用純水作為流動相[8-9]。然而，采用100%水作為流動相不僅會縮短色譜柱的使用壽命，還可能引起峰形異常，對色譜柱的性能要求較高。此外，由于維生素E具有較強的脂溶性且在色譜系統(tǒng)中保留較強，通常采用100%甲醇作為流動相以實現(xiàn)其有效洗脫[15]?？疾炝思状?水和乙腈-水兩種流動相體系在梯度洗脫條件下的應(yīng)用效果，結(jié)果表明：采用甲醇-水作為流動相時，尿素能獲得良好的峰形和柱效；而當流動相過渡至100%甲醇時，維生素E的出峰時間較為理想。基于上述結(jié)果，最終確定采用梯度洗脫方案：首先使用甲醇-水(體積比5∶95)進行初步洗脫以分離尿素，隨后逐步過渡至100%甲醇洗脫維生素E，最后通過設(shè)置適當?shù)钠胶鈺r間，使流動相系統(tǒng)恢復(fù)至初始比例，確保后續(xù)樣品測定的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.2.3 色譜柱選擇

考察了3種不同型號的色譜柱[Inertsil ODS-SP C18 (250 mm×4.6 mm，5µm)、Phenomenex Luna C18 (250 mm×4.6 mm，5µm)、Agilent Eclipse Plus C18 (250 mm×4.6 mm，5µm)]的分離性能。在1.2色譜條件下進樣分析，結(jié)果表明，使用Agilent Eclipse Plus C18和Phenomenex Luna C18 色譜柱時，維生素E色譜峰峰形均較差。Inertsil ODS-SP C18色譜柱洗脫出維生素E色譜峰峰形較好，出峰時間較短，且尿素色譜峰的理論塔板數(shù)和拖尾因子也更優(yōu)，因此選擇Inertsil ODS-SP C18柱作為色譜柱。

2.2.4 進樣體積、柱溫的選擇

考察了不同進樣體積(10、15、20 μL)和不同柱溫(25、30、35 ℃)對色譜柱柱效和出峰情況的影響。結(jié)果表明，進樣體積不同時，各色譜峰理論塔板數(shù)和拖尾因子接近；柱溫不同時，尿素出峰時間不受影響，而維生素E出峰時間隨著溫度升高略有減小，各溫度下色譜峰理論塔板數(shù)和拖尾因子無顯著差別。考慮到最小進樣體積即可滿足實驗要求，且柱溫25 ℃時，儀器能耗較低，最終確定進樣體積為10 μL，柱溫為25 ℃。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗

取混合對照品溶液、陽性樣品溶液和陰性樣品溶液，在1.2色譜條件下進樣測定。陰性樣品溶液、混合對照品溶液、陽性樣品溶液色譜圖如圖3所示。從圖3中可以看出，混合對照品溶液中尿素和維生素E出峰時間分別約為3.0、21.5 min，陽性樣品溶液中兩種主成分出峰時間與混合對照品溶液一致；陰性樣品溶液在相同保留時間處無干擾峰，樣品中的輔料(出峰時間分別約為14 min和15 min)對主成分檢測無干擾，該方法專屬性良好。

圖3   陰性樣品溶液、混合對照品溶液、陽性樣品溶液色譜圖

Fig. 3   Chromatographic diagram of negative sample solution，mixed reference solution and positive sample solution

2.3.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

取系列混合標準工作溶液，在1.2色譜條件下進樣測定。以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，以色譜峰面積為縱坐標(y)，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。取系列混合標準工作溶液用乙腈逐級稀釋，分別以信噪比約為3和10時對應(yīng)的質(zhì)量濃度計算方法檢出限和定量限，根據(jù)稱樣質(zhì)量和定容體積換算為樣品中的含量，以質(zhì)量分數(shù)表示（mg/kg）。尿素和維生素E質(zhì)量濃度的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表2。由表2可知，尿素和維生素E的質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 4和0.999 9，檢出限分別為0.006 μg/mL和0.01 μg/mL，定量限分別為0.02 μg/mL和0.05 μg/mL，該方法靈敏度較高。

表2   尿素和維生素E質(zhì)量濃度的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

Tab. 2   Linear range，linear equation，correlation coefficient，limit of detection and limit of quantitation of urea and vitamin E mass concentration

 

2.3.4 精密度試驗

取陽性樣品(批號為240902)，按照1.4平行制備6份樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進樣，分別測定每份樣品的質(zhì)量分數(shù)，精密度試驗結(jié)果見表3。由表3可知，尿素、維生素E測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)分別為0.80%和0.90%(n=6)，表明該方法精密度良好。

表3   精密度試驗結(jié)果

Tab. 3   Result of precision test

 

2.3.5 加標回收試驗

取陽性樣品(批號為240902)，按照1.4樣品處理方法平行制備9份陽性樣品溶液，平均分成3組。每組陽性樣品溶液分別取1 mL，精密加入不同體積(0.8、1.0、1.2 mL)的混合對照品溶液，分別置于同一5 mL容量瓶中，加入乙腈稀釋至標線，搖勻，在1.2色譜條件下進行加標回收試驗，加標回收試驗結(jié)果見表4。由表4可知，尿素和維生素E的平均回收率分別為101%和100%。

表4   加標回收試驗結(jié)果

Tab. 4   Results of spiked recovery test

 

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

取陽性樣品(批號為240902)，按照1.4樣品處理方法制備陽性樣品溶液，分別于制備后第0、2、4、8、12、24 h，在1.2色譜條件下進樣，穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表5。由表5可知，尿素質(zhì)量分數(shù)的RSD為0.70%；維生素E質(zhì)量分數(shù)的RSD為0.60%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5   穩(wěn)定性試驗結(jié)果

Tab. 5   Results of stability test

 

3 結(jié)論

（1）建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器波長切換法，在一個色譜系統(tǒng)中同時測定尿素維E乳膏中尿素和維生素E含量。該方法專屬性強、準確性好、簡便高效。（2）高效液相色譜-二極管陣列檢測器波長切換法解決了單一波長下，無法同時獲得尿素和維生素E較好響應(yīng)信號的問題。該方法既確保兩種成分獲得良好的檢測響應(yīng)，又簡化了分析流程，實現(xiàn)直觀的定量分析。（3）目前，該方法只提供了尿素和維生素E兩種主成分測定方法，未對防腐劑羥苯乙酯等輔料質(zhì)量進行控制，后續(xù)將優(yōu)化色譜條件，對輔料成分進行考察，進而提高和完善相應(yīng)的藥品質(zhì)量標準，為尿素維E乳膏的質(zhì)量控制和監(jiān)管提供有力支撐，為患者安全用藥提供可靠保障。

 

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