琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHI）類殺菌劑作為一種新型農(nóng)藥，在防治作物病害（如葡萄灰霉病、谷子黑穗病等）中發(fā)揮重要作用，市場價值巨大。近十余年來，SDHI 類殺菌劑新品推出快速，目前已上市產(chǎn)品超過20個，且產(chǎn)品種類仍在不斷更新。隨著該類殺菌劑在農(nóng)業(yè)中的廣泛使用，為保障食品安全，各國及國際組織相繼制定了嚴(yán)格的SDHI類殺菌劑殘留限量標(biāo)準(zhǔn)并加大監(jiān)管力度。
干辣椒作為國際貿(mào)易中的重要農(nóng)產(chǎn)品，其安全性備受關(guān)注。歐盟已對香料進口實施嚴(yán)格管控，國際食品法典委員會也對辣椒類產(chǎn)品中農(nóng)藥最大殘留限量進行了修訂。然而，在國家標(biāo)準(zhǔn) GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中，僅對5種SDHI類殺菌劑（苯并烯氟菌唑、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、吡噻菌胺）在干辣椒中的最大殘留限量作出了規(guī)定，其中僅啶酰菌胺可依據(jù)GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進行檢測，其余4種均為臨時限量，導(dǎo)致無法對干辣椒基質(zhì)中多種 SDHI 類殺菌劑的殘留量進行分析。因此，建立一種能夠快速、高效、準(zhǔn)確地檢測干辣椒中多種 SDHI類殺菌劑痕量殘留的分析方法十分重要，可為相關(guān)農(nóng)藥殘留監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)。
目前，SDHI類殺菌劑的常用分析方法主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）、液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。與液相色譜法、氣相色譜法及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比，HPLC-MS/MS不僅分析更加快速、鑒定能力更強，且對復(fù)雜基質(zhì)也具有更優(yōu)的抗干擾性能，因而被廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)藥殘留的檢測?，F(xiàn)有研究主要集中于果蔬類、糧谷類和肉類中SDHI類殺菌劑殘留的檢測，而針對干辣椒基質(zhì)的相關(guān)研究尚未見報道。研究人員采用QuEChERS凈化，以HPLC-MS/MS同時測定干辣椒中21種SDHI類殺菌劑的殘留量，以期為干辣椒中該類殺菌劑的殘留監(jiān)控提供有效的技術(shù)手段。
1 試驗方法
1.1 樣品的前處理
用粉碎機將干辣椒樣品打磨成粉，混勻，過標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，得到均質(zhì)樣品。稱取上述粉狀均質(zhì)樣品，加入甲酸溶液，渦旋混勻，靜置，加入正己烷飽和的乙腈溶液，振蕩，加入 QuEChERS萃取鹽包，迅速搖勻，振蕩，離心。取上清液置于裝有無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）和石墨化碳黑（GCB）的離心管中，渦旋，離心。取上清液，加入水，混勻，過濾膜，濾液按照儀器工作條件測定。
1.2 基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的制備
按照試驗方法制備空白干辣椒樣品溶液，用其逐級稀釋21種SDHI類殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。
1.3 數(shù)據(jù)處理
采用OriginLab 2021和ChemDraw 20.0繪制圖表。
2 結(jié)果與討論
2.1 流動相的選擇
在農(nóng)藥殘留檢測工作中，HPLC-MS/MS常用的流動相主要由有機相（如甲醇、乙腈）和水相（含不同添加劑的溶液，如乙酸銨溶液、甲酸銨溶液、甲酸溶液和乙酸溶液等）組成。試驗考察了甲醇與含不同體積分?jǐn)?shù)（0.01％，0.1％，0.5％，1％）甲酸的5mmol·L−1甲酸銨溶液體系作為流動相時對21種目標(biāo)物信號響應(yīng)和分離度的影響。結(jié)果顯示：流動相中水相的酸度對分離效果具有明顯影響，當(dāng)水相中甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.01％時，21種目標(biāo)物的色譜峰會出現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象；當(dāng)水相中甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1％時，21種目標(biāo)物的色譜峰峰形對稱性良好，分離度滿足檢測要求，且具有較高的檢測靈敏度；當(dāng)水相中甲酸體積分?jǐn)?shù)超過0.1％時，21種目標(biāo)物的分離度明顯降低，同時檢測靈敏度下降。因此，試驗選擇甲醇-含0.1％甲酸的5mmol·L−1甲酸銨溶液體系作為流動相。在優(yōu)化的儀器工作條件下，0.1mg·L−1SDHI類殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖如圖1所示。
2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
為獲得21種目標(biāo)物最優(yōu)的分離效果與靈敏度，試驗首先對1.0mg·L−1 SDHI類殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行正、負(fù)離子掃描，結(jié)果顯示，在ESI＋掃描模式下，21種目標(biāo)物均呈現(xiàn)良好的信號響應(yīng)。隨后，以0.5mg·L−121種 SDHI類殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對象，通過蠕動泵以10μL·min−1的流量連續(xù)注入ESI源，通過一級質(zhì)譜分析獲取準(zhǔn)分子離子峰，并優(yōu)化去簇電壓；基于準(zhǔn)分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析，解析碎片離子信息并優(yōu)化碰撞能量。最終，選取經(jīng)碰撞能量優(yōu)化后信號強度最高的離子作為定量子離子，從剩余的子離子中選取信號強度僅次于定量子離子、基線噪聲低且無明顯干擾的離子作為定性子離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。
2.3 前處理條件的優(yōu)化
2.3.1 提取溶劑
干辣椒作為一種復(fù)雜的基質(zhì)，其中含有辣椒紅素、辣椒堿、油脂等，試驗以加標(biāo)空白干辣椒樣品（加標(biāo)量 0.01mg·kg−1）為研究對象，考察了不同提取溶劑（乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷飽和的乙腈溶液）的提取效果。結(jié)果顯示：采用丙酮提取時，干辣椒中大量色素、脂肪等非極性雜質(zhì)成分進入提取液，增加了后續(xù)凈化的難度；采用乙酸乙酯提取時，提取液中雜質(zhì)較少，但提取效果不如乙腈；采用乙腈提取時，21種目標(biāo)物的回收率為92.9％～118％；采用正己烷飽和的乙腈溶液提取時，21種目標(biāo)物的回收率為87.6％～106％。由于干辣椒樣品需先經(jīng)10mL0.1％甲酸溶液浸泡，而乙腈與水有一定的互溶性，可更好地滲透進入樣品，從而提高提取效率，此外，乙腈能夠有效去除蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)，而正己烷飽和的乙腈溶液可更有效地去除干辣椒中的油脂類雜質(zhì)，從而得到更清澈、顏色更淺的提取液。因此，試驗選擇正己烷飽和的乙腈溶液作為提取溶劑。
2.3.2 凈化劑
在食品農(nóng)藥殘留檢測中，QuEChERS因其快速、簡便、經(jīng)濟、高效、可靠和安全而被廣泛應(yīng)用，該方法常采用PSA、C18、無水硫酸鎂及 GCB等分散吸附劑進行凈化。對于干辣椒基質(zhì)，PSA可去除有機酸、維生素、糖類和脂肪酸等雜質(zhì)；GCB可消除辣椒紅素等色素干擾；C18能有效去除非極性脂肪和脂溶性雜質(zhì)；無水硫酸鎂可消除水分的干擾。試驗以加標(biāo)空白干辣椒樣品（加標(biāo)量0.01mg·kg−1）為研究對象，考察了凈化劑組合A（150mg無水硫酸鎂＋50mgPSA＋50mgC18）、凈化劑組合B（150mg無水硫酸鎂＋50mg PSA＋100mgC18）、凈化劑組合C（150mg無水硫酸鎂＋100mgPSA＋50mgC18）、凈化劑組合 D（150mg無水硫酸鎂＋50mgPSA＋50mgC18＋10mgGCB）、凈化劑組合 E（150mg無水硫酸鎂＋50 mg PSA＋50 mg C18＋20 mg GCB）、凈化劑組合F（150mg無水硫酸鎂＋50mgPSA＋50mgC18＋50mg GCB）的凈化效果，以21種目標(biāo)物的回收率為評價指標(biāo)，結(jié)果見圖2。
由圖2可知，采用凈化劑組合E 凈化時，21種目標(biāo)物的回收率最佳，為90.2％～106％。因此，試驗選擇凈化劑組合E（150mg無水硫酸鎂＋50mgPSA＋50mgC18＋20mgGCB）作為QuEChERS凈化方法的凈化劑。
2.4 基質(zhì)效應(yīng)
干辣椒基質(zhì)中存在多種組分，可能對目標(biāo)物的檢測產(chǎn)生干擾，影響定量分析的準(zhǔn)確度與精密度。試驗通過基質(zhì)效應(yīng)（ME）考察樣品溶液對21種目標(biāo)物的影響，以空白樣品溶液和純?nèi)軇ㄒ译妫┡渲频幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液系列繪制的工作曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比計算ME值，以評估基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)ME值為0.9～1.1時，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱；當(dāng)ME值小于0.9時，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)ME值大于1.1時，表明存在基質(zhì)增強效應(yīng)。結(jié)果顯示，除異丙噻菌胺的ME值為1.59，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)外，其余20種目標(biāo)物的 ME值為 0.06～0.67，均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。為降低基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，試驗選擇基質(zhì)匹配法進行定量分析。
2.5 工作曲線和測定下限
按照儀器工作條件測定基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以21種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)定量子離子的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示，21種目標(biāo)物工作曲線的線性范圍均為0.001～0.5mg·L−1，相關(guān)系數(shù)為0.9989～0.9999。
按照試驗方法測定空白樣品溶液，以10倍信噪比（S/N）計算測定下限（10S/N），結(jié)果顯示，21種目標(biāo)物的測定下限均為0.01mg·kg−1。
2.6 精密度和回收試驗
對干辣椒樣品進行低（加標(biāo)量0.01mg·kg−1）、中（加標(biāo)量0.02mg·kg−1）、高等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，每個濃度水平平行配制 6 份，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。其中，高濃度水平的加標(biāo)量參考了多國標(biāo)準(zhǔn)中的最大殘留限量值，具體如下：苯并烯氟菌唑、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、吡噻菌胺參考GB 2763—2021，加標(biāo)量分別為9，30，6，14mg·kg−1；啶酰菌胺、氟唑菌酰羥胺參考美國聯(lián)邦法規(guī)，加標(biāo)量分別為 30，5mg·kg−1；萎銹靈參考?xì)W盟標(biāo)準(zhǔn)，加標(biāo)量為0.1 mg·kg−1；其余14種目標(biāo)物的加標(biāo)量均為0.05mg·kg−1。結(jié)果顯示，21種目標(biāo)物的回收率為79.0％～108％，測定值的RSD為0.53％～14％，說明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。
2.7 樣品分析
按照試驗方法分析20批市售干辣椒樣品，結(jié)果顯示，21種目標(biāo)物均未檢出。
3 試驗結(jié)論
研究人員提出了HPLC-MS/MS 同時測定干辣椒中21種SDHI類殺菌劑殘留量的方法。該方法基于QuEChERS前處理技術(shù)，凈化效果良好，具有操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確度高和精密度好等優(yōu)點，可為干辣椒中SDHI類殺菌劑的日常殘留監(jiān)測工作提供技術(shù)參考，滿足日益增長的國際貿(mào)易需求及口岸安全監(jiān)管需要。
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