采用富集培養(yǎng)、以中藥廢水為單一碳源定向梯度馴化的方法，從處理中藥廢水的 3 個階段中篩選微生物菌株，從進水口階段篩選到 6 株菌株、曝氧池階段篩選到 3 株菌株、好氧池階段篩選到 4 株菌株，對篩選到的菌株進行鑒定及形態(tài)觀察，初步判定均為條件致病菌；為中藥廢水的微生物處理提供了應(yīng)對措施參考，進一步有效降低對環(huán)境和健康的潛在威脅。
隨著制藥工業(yè)的迅速發(fā)展，中藥廢水的排放已成為威脅人類健康的污染源之一[1]。由于中藥制藥原材料源于中藥材，中藥廢水的產(chǎn)生主要在于中藥的清洗、蒸煮、清潔、制劑等過程[2]，中藥廢水中含有一些多糖、木質(zhì)素、鞣質(zhì)、生物堿、色素和少量的金屬離子[3]，中藥廢水具有生物降解能力差、有機污染物種類繁多、濃度高且毒性強的特性，處理高濃度有機廢水的難度較大，給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來威脅[4]。目前物理法、化學(xué)法和生物法[5-7]以及組合工藝處理中藥廢水是最常用的方法，但處理能力均有限，目前比較成熟的工藝有活性污泥法、氧化溝、AO、A20、SSBR 生物膜法、曝氣生物濾池、接觸氧化床等，這些工藝都是依靠微生物的氧化分解作用，通過微生物的代謝作用進行物質(zhì)轉(zhuǎn)化，將污水中的各種大分子復(fù)雜的有機物降解為小分子簡單的物質(zhì)[8-9]。目前，對活性污泥的研究主要集中在污水處理的不同反應(yīng)階段以及不同處理對象的沉淀池活性污泥微生物群落的生態(tài)演替規(guī)律，活性污泥中的微生物群落組成及功能菌群也非常的豐富[10]。本試驗選取的制藥廠進行污水處理一共分為進水口、曝氧池、好氧池、沉淀池以及出水口五個階段，其中用于進行污水處理的有進水口、曝氧池和好氧池 3 個階段，因此，本試驗從進水口、好氧池和曝氧池 3 個階段中篩選微生物菌株，了解 3個階段在污水處理過程中是否存在其他有害微生物，及時采取應(yīng)對措施并加強管理，可以有效降低對環(huán)境和健康的潛在威脅。
Part1材料與方法
1.1材料
樣本采集于貴州省某制藥公司，進水口、好氧池和曝氧池三個階段的水樣。
1.2培養(yǎng)基
(1)葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(富集培養(yǎng)基)：葡萄糖 6 g、蛋白胨 2 g、磷酸二氫鉀 1 g、7 水硫酸鎂 1 g，pH 7.2~7.5，121 ℃高壓滅菌 20 min。(2)馴化選擇培養(yǎng)基：磷酸銨 3 g、12 水磷酸氫二鈉 1.26 g、磷酸二氫鉀 0.5 g、7 水硫酸鎂 0.2 g，微量元素 1 mL，pH 7.2~7.5，121 ℃高壓滅菌 20 min。其中，微量元素：7 水硫酸鐵 0.5 g、氯化鈣 0.15 g、1 水硫酸錳 0.09 g、7 水硫酸鋅 0.27 g，1000 mL 蒸餾水。(3)菌種分離培養(yǎng)基：加入 24 g 瓊脂在馴化選擇培養(yǎng)基中，以中藥廢水代替蒸餾水，其他元素與馴化選擇培養(yǎng)基相同。
1.3方法
1.3.1 菌種的富集培養(yǎng)
取進水口、曝氧池、好氧池 3 個不同階段下廢水，每種廢水 3 個平行處理，按 50 mL/瓶進行分瓶滅菌，121 ℃滅菌 20 min。取不同階段的活性污泥混合液 5 mL，按 1 %(V/V)接種量接入50 mL富集培養(yǎng)基中，每個處理進行3個平行，以30 ℃，120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，72 h 為一個周期，反復(fù)富集 3 三個周期。
1.3.2 菌種的馴化培養(yǎng)
以中藥廢水為唯一的碳源，不額外添加其他的外加碳源；將在富集培養(yǎng)條件下的混合菌液 50 mL 接種在馴化選擇培養(yǎng)基中，以 30 ℃，120 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，中藥廢水初始添加量為培養(yǎng)液的 20 %，按 40 %、60 %、80 %、100 %添加量依次加入馴化培養(yǎng)基中，每隔 6 h 取樣測定培養(yǎng)液菌濁(OD600)的變化情況，以馴化培養(yǎng)基作為試劑空白，培養(yǎng)基明顯渾濁后，然后將此渾濁液按 1 %接種量接入新鮮馴化培養(yǎng)基中，同時接入 40 %無菌中藥廢水，在 30 ℃，120 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，每隔 24 h 測一次 OD600(以各自濃度梯度培養(yǎng)基作為空白)直至菌液明顯變渾濁，再轉(zhuǎn)接下一個梯度，直到 100 %。
1.3.3 菌種分離
取選擇馴化培養(yǎng)時中藥廢水最高濃度的混合菌培養(yǎng)液作為菌種分離的菌源，以中藥廢水代替蒸餾水，在無菌條件下反復(fù)進行平板劃線分離純化。
1.3.4 16S rRNA 鑒定
使用 DNA 提取試劑盒獲取基因組 DNA，并利用 16SrDNA 通用引物 27 F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492 R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)進行 PCR 擴增。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 3 分鐘；94 ℃變性 1 分鐘；56 ℃退火 1 分鐘；72 ℃延伸 2 分鐘，循環(huán) 30 次；最后在 72 ℃延伸 10 分鐘并在 4 ℃終止。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過試劑盒純化后送至上海生物工程有限公司進行序列測定。
1.3.5 形態(tài)學(xué)觀察
接種菌種在牛肉膏蛋白胨平板上培養(yǎng) 48 h 后觀察其菌落形態(tài)特征及顯微形態(tài)特征。生理生化特征的鑒定參照《微生物實驗教程》中相關(guān)方法進行。
Part2結(jié)果與分析
2.1 菌種的富集培養(yǎng)
富集培養(yǎng)是在混合菌群中培養(yǎng)特定優(yōu)勢菌種，增加其數(shù)量比例，達到純培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法。經(jīng)富集培養(yǎng)后，其他非目標(biāo)微生物也會不斷增殖，因此經(jīng)富集培養(yǎng)后將得到渾濁度雜菌培養(yǎng)液。本試驗中，取進水口、曝氧池、好氧池 3 個不同階段下廢水，按活性污泥混合液 1 %(V/V)的接種量接入 50 mL 富集培養(yǎng)基中，以 30 ℃，120 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，以 72 h為一個周期，反復(fù)富集 3 三個周期，得到的雜菌培養(yǎng)液，如圖1 所示。
A：好氧池富集培養(yǎng)第一階段 72 h 培養(yǎng)前；B：曝氧池富集培養(yǎng)第一階段 72 h 培養(yǎng)前；C：進水口富集培養(yǎng)第一階段 72 h 培養(yǎng)前；a：好氧池富集培養(yǎng)第三階段 216 h 培養(yǎng)后 b：好氧池富集培養(yǎng)第三階段 216 h 培養(yǎng)后 c：好氧池富集培養(yǎng)第三階段 216 h 培養(yǎng)后
圖 1 菌種的富集培養(yǎng)
2.2 菌種的馴化培養(yǎng)
以中藥廢水初始添加量為培養(yǎng)液的 20 %，按 40 %、60 %、80 %、100 %添加量依次加入馴化培養(yǎng)基中。本試驗中，在好氧池中，中藥廢水添加量為 40%時，菌液 OD600 值 0.877，達到最大值；在曝氧池中，中藥廢水添加量為 40 %時，菌液OD600 值 0.163，達到最大值；在進水口中，中藥廢水添加量為 80 %時，菌液 OD600 值 0.153，達到最大值；以上的結(jié)果表明，當(dāng)中藥廢水比例提高至 40 %時，好氧池與曝氧池能適應(yīng)該濃度有機物的微生物種類相同，菌株生長能力均達到最大值，但隨著高濃度中藥廢水量的提高，耐受性的菌種種類和數(shù)量逐漸降低，菌株生長均受到不同程度的抑制。當(dāng)中藥廢水比例提高至 80 %時，進水口能適應(yīng)該濃度有機物耐受性的菌種種類和數(shù)量及菌株生長能力均達到最大值。
圖 2 不同比例制藥廢水梯度 OD600
2.3 菌種的分離及鑒定
本試驗中，從中藥制藥廠污水中對微生物進行篩選并鑒定，一共獲得 11 株菌株，其中，在好氧池中，一共篩選得到4 種菌株，分別為 Klebsiella pneumoniae strain(肺炎克雷伯氏菌)、Bacillus subtilis strain(枯草芽孢桿菌菌株)、Bacterium strain(細菌菌株)和 Chryseobacterium gleum strain(粘金黃桿菌)，其中，肺炎克雷伯氏菌，克雷伯氏桿菌為條件病原菌，主要寄生于動物呼吸道或腸道，是引起人類肺炎的病原菌之一；在曝氧池中，一共篩選到 3 種菌株，分別為 Acinetobacter sp(不動桿菌屬)、Klebsiella pneumoniae subsp(肺炎克雷伯氏菌亞種)和 Acinetobacter baumannii strain (鮑曼不動桿菌株)，其中鮑曼不動桿菌株為條件致病菌。在進水口中，一共篩選到 7種菌株，分別為 Pseudomonas nitroreducens strain(硝基還原假單胞菌)、Bacterium strain(細菌菌株)、Sphingobium yanoikuyae strain(矢野口鞘氨醇菌)、Agrobacterium tumefaciens strain (根癌農(nóng)桿菌菌株)、Pseudomonas nitroreducens strain 硝基還原假單胞菌中的 Pseudomonas nitroreducens strain(硝基還原假單胞菌)、Pseudomonas aeruginosa strain (銅綠假單胞菌)以及Microbacterium sp. Strain 微細菌屬中的 Microbacteriaceae bacterium( 微 細 菌 科 細 菌 ) 、 Microbacterium laevaniformans strain(產(chǎn)左聚糖微桿菌)，假單胞菌屬廣泛分布于自然界水中，土壤及人和動物體表，屬于條件致病菌；銅綠假單胞菌為革蘭氏陰性菌、好氧，屬致病菌。
2.4 菌種形態(tài)學(xué)觀察
硝基還原假單胞菌(圖 3 A、C)為革蘭氏陰性，菌落半透明，菌落無規(guī)則，表面光滑；矢野口鞘氨醇菌(圖 3 B)為革蘭氏陰性、好氧，最適生長溫度 30 ℃；肺炎克雷伯氏菌(圖 3 D)革蘭氏陰性桿菌，菌落白色、無規(guī)則，兼性厭氧；粘金黃桿菌(圖3 F)，菌落為圓形，黃色，不透明，表面光滑，邊緣整齊；細菌(圖 3 E)無莢膜，無芽孢，革蘭氏染色為陰性；不動桿菌屬(圖3 G、J、K)菌落黃色、無規(guī)則；肺炎克雷伯氏菌亞種(圖 3 H、I)革蘭氏陰性桿菌，菌落淡粉色、白色無規(guī)則，兼性厭氧。
A-C：進水口階段；D-F：好氧池階段；
G-K：曝氧池階段；k：顯微鏡下形態(tài)
圖 3 3 個階段微生物菌種的形態(tài)
Part3小結(jié)與討論
本試驗中，采用富集培養(yǎng)、以中藥廢水為單一碳源定向梯度馴化的方法，從處理中藥廢水的 3 個階段進水口、曝氧池和好氧池中篩選微生物菌株，一共篩選了 11 種菌株，其中，從進水口階段篩選到 6 株菌株、曝氧池階段篩選到 3 株菌株、好氧池階段篩選到 4 株菌株；對篩選到的菌株進行鑒定及形態(tài)觀察，其中肺炎克雷伯氏菌、假單胞菌屬、粘金黃桿菌等均為條件致病菌，肺炎克雷伯菌是廣泛存在于自然界環(huán)境中的革蘭氏陰性致病桿菌，可在健康人群的呼吸道以及腸道中潛伏，引起肺炎、尿路感染以及肝膿腫等疾病[11]，粘金黃桿菌引起的感染通常是醫(yī)院獲得性肺炎及菌血癥[12-14]，在肺囊性纖維化患者肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)了粘金黃桿菌與銅綠假單胞菌，都是其潛在致病菌[15]。
因此，在實際的生產(chǎn)以及污水處理中意外發(fā)現(xiàn)了致病菌，這可能會帶來一些潛在的風(fēng)險和問題。以下是面對這種情況的應(yīng)對措施和注意事項：
(1)風(fēng)險評估：對致病菌進行詳細的檢測和鑒定，確定其種類和致病能力；評估其存在的數(shù)量及在污水處理過程中的傳播風(fēng)險，明確對操作人員、環(huán)境以及后續(xù)排放水體的潛在危害。
(2)加強防護措施：加強實驗室操作和污水處理操作人員的防護措施，如佩戴手套、口罩、防護服等，防止直接接觸含有致病菌的樣品；提高實驗室和污水處理區(qū)域的生物安全等級，防止致病菌擴散或污染其他環(huán)境。
(3)做好滅菌處理：采取有效的滅菌措施，如高溫滅菌、化學(xué)消毒或紫外線照射，對致病菌進行徹底滅殺；對含有致病菌的污水和污泥進行專門處理，避免在未經(jīng)徹底滅菌的情況下直接排放或處理。
(4)安全排放控制：在確保致病菌被有效控制和滅殺之前，嚴禁將污水排入外界水體，以免對環(huán)境和公眾健康造成威脅。定期監(jiān)測排放水中的微生物含量，確保其符合國家排放標(biāo)準。
(5)記錄與報告：詳細記錄篩菌過程中發(fā)現(xiàn)致病菌的情況，包括菌種的種類、數(shù)量、檢測過程等信息。向相關(guān)環(huán)保和衛(wèi)生監(jiān)管部門報告此情況，并配合其進行后續(xù)的監(jiān)控和管理措施。
在污水處理過程中發(fā)現(xiàn)致病菌，及時采取應(yīng)對措施并加強管理，可以有效降低對環(huán)境和健康的潛在威脅。
參考文獻
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