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摘 要： 建立液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定舒巴坦鈉原料藥中雜質(zhì)G-亞磺酸酯含量的分析方法。色譜柱選用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙酸銨溶液-甲醇為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流量為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為1 μL；質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。雜質(zhì)G-亞磺酸酯的質(zhì)量濃度在0.224～1.495 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 0，檢出限為0.5 mg/g，定量限為1.5 mg/g。測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%（n=6），樣品加標(biāo)平均回收率為98.5%。對照品溶液與加標(biāo)樣品溶液在10.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.6%（n=5）和4.9%（n=5）。該方法可有效用于舒巴坦鈉中雜質(zhì)G-亞磺酸酯的痕量檢測與質(zhì)量控制。

 

關(guān)鍵詞： 舒巴坦鈉； 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法； 亞磺酸酯

 

舒巴坦鈉屬于β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類藥物，臨床常與其他抗生素聯(lián)合應(yīng)用，用于治療由各類敏感細(xì)菌引起的感染［1-3］。舒巴坦鈉為發(fā)酵產(chǎn)物衍生的半合成產(chǎn)品［4］，其化學(xué)名稱為（2S，5R）-3，3-二甲基-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環(huán)［3.2.0］庚烷-2-羧酸鈉4，4-二氧化物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1   舒巴坦鈉結(jié)構(gòu)式

Fig. 1   Structural formula of sulbactam sodium

 

遺傳毒性雜質(zhì)研究是藥品質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟，遺傳毒性雜質(zhì)來源廣泛，包括原料藥的生產(chǎn)工藝，如起始原料、反應(yīng)物、催化劑、試劑、溶劑、中間體和副產(chǎn)物，以及降解產(chǎn)物等［5-8］。試劑與溶劑之間的相互作用往往也會產(chǎn)生新的副產(chǎn)物，典型的例子是工藝中使用的磺酸或者磺酰氯與醇類溶劑反應(yīng)，生成磺酸酯類遺傳毒性雜質(zhì)［9-11］。舒巴坦鈉生產(chǎn)工藝中可能產(chǎn)生《歐洲藥典》（EP）規(guī)定的相關(guān)雜質(zhì)，其中EP雜質(zhì)G為工藝相關(guān)亞磺酸類雜質(zhì)，其化學(xué)名稱為（2S）-2-［［（2E）-2-羧基乙烯基］氨基］-3-甲基-3-亞磺?；∷?，結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2   EP雜質(zhì)G結(jié)構(gòu)式

Fig. 2   EP impurity g structural formula

該工藝路線中還用了乙醇溶劑，因此亞磺酸雜質(zhì)有和乙醇反應(yīng)生成亞磺酸酯的風(fēng)險，反應(yīng)過程如圖3所示。

圖3   EP雜質(zhì)G與乙醇反應(yīng)過程

Fig. 3   Reaction process of EP impurity g with ethanol

磺酸酯類為已知遺傳毒性雜質(zhì)，其遺傳毒性通過直接烷基化機制產(chǎn)生［12］，但亞磺酸酯類的遺傳毒性尚未明確。權(quán)威文獻(xiàn)中，包括國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評中心（CDE）發(fā)布的遺傳毒性雜質(zhì)警示結(jié)構(gòu)相關(guān)文件［13-14］，均未將亞磺酸酯類納入警示結(jié)構(gòu)清單中。然而，CDE在舒巴坦鈉的發(fā)布意見中明確要求，需將該類雜質(zhì)按照遺傳毒性雜質(zhì)對原料藥及相關(guān)制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。參照國際人用藥品注冊技術(shù)要求協(xié)調(diào)會 ICH M7協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則，將EP雜質(zhì)G-亞磺酸酯歸類為3類雜質(zhì)，采用毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）法計算其控制限度。舒巴坦鈉作為抗感染藥物，臨床存在重復(fù)用藥場景，按照1~12 個月用藥周期計，EP雜質(zhì)G-亞磺酸酯的可接受攝入量為 20 μg/d；結(jié)合舒巴坦鈉最大日劑量為4 g，推算得出該雜質(zhì)控制限度值為20 μg/（4 g），即為5 μg/g。截至目前，國內(nèi)外關(guān)于舒巴坦鈉中亞磺酸酯類雜質(zhì)的研究較為匱乏，僅有1篇專利文獻(xiàn)報道了以EP雜質(zhì)A-亞磺酸酯為研究對象，采用液相色譜-四級飛行時間質(zhì)譜（LC-QTOF）技術(shù)建立的檢測方法［15］，而針對EP雜質(zhì)G-亞磺酸酯的方法學(xué)研究尚未見公開報道。筆者采用三重四級桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)，首次建立了EP雜質(zhì)G-亞磺酸酯的定量分析方法，該方法靈敏度高、專屬性強，可實現(xiàn)舒巴坦鈉中該雜質(zhì)的精準(zhǔn)定量檢測。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：1290 Infinity Ⅱ/G6470B型，配G7120A二元泵、G7167B 自動液體進(jìn)樣器，美國安捷倫科技有限公司。電子天平：QUINTIX125D-1CN/SQP型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。超純水機：FDY8002-UV-E型，青島富勒姆科技有限公司。甲醇：色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司。乙酸銨：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。雜質(zhì)G-亞磺酸酯對照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為100%，批號為ES27562-28-P1，上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司。舒巴坦鈉樣品：0.5 g，批號為STD-220801，某企業(yè)提供。實驗用水為超純水，由青島富勒姆超純水機制得，臨用新制。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技有限公司）；柱溫：30 ℃；流動相：A相為0.009 mol/L乙酸銨溶液，B相為甲醇，流量為0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL；洗脫方式：梯度洗脫，梯度洗脫程序如表1所示。

表1   梯度洗脫程序

Tab. 1   Gradient elution procedures

 

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；電離方式：正離子；噴嘴電壓：0 V；干燥氣：氮氣，溫度為350 ℃，流量為11 L/min；鞘氣：氮氣，溫度為320 ℃，流量為11 L/min；霧化器壓力： 241.32 KPa；毛細(xì)管電壓：3 500 V；雜質(zhì)G-亞磺酸酯的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2   雜質(zhì)G-亞磺酸酯保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

Tab. 2   Retention time and mass spectrometry parameters

 

1.3 溶液配制

1.3.1 樣品溶液

取舒巴坦鈉樣品約0.03 g，精密稱定于200 mL容量瓶中，加入水溶解并定容至標(biāo)線，使舒巴坦鈉的質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，作為樣品溶液。另取水作為空白溶液。

1.3.2 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

精密量取雜質(zhì)G-亞磺酸酯對照品適量，置于100 mL容量瓶中，加入水，定容至標(biāo)線，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.224、0.374、0.748、1.121、1.495 ng/mL的雜質(zhì)G-亞磺酸酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 定量方法

按照1.2儀器工作條件，分別測定雜質(zhì)G-亞磺酸酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，記錄色譜峰面積，以雜質(zhì)G-亞磺酸酯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，按照色譜峰面積外標(biāo)法計算樣品中的雜質(zhì)G-亞磺酸酯含量。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱溫度

按1.3方法制備加標(biāo)樣品溶液，將色譜柱溫度分別設(shè)定為27、30、33 ℃，在保持1.2設(shè)定的其他儀器條件不變的情況下，每個溫度點平行測定2次，并計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），試驗結(jié)果見表3。由表3可知，當(dāng)色譜柱溫度處于27～33 ℃區(qū)間時，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%，說明該溫度變化對測定結(jié)果影響較小，方法靈敏度能夠滿足檢測需求。綜合考量儀器運行過程中的固有波動性，最終將色譜柱柱溫選定為中間值30 ℃，以確保檢測方法具備良好的重復(fù)性。

表3   不同色譜柱溫度時試驗結(jié)果

Tab. 3   Determination results of different column temperature

 

2.1.2 柱流量

按1.3方法制備加標(biāo)樣品溶液，將色譜柱流量分別調(diào)整為0.18、0.2、0.22 mL/min，在保持1.2設(shè)定的其他儀器條件不變的情況下，每個流量條件下平行測定2次，計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗結(jié)果見表4。由表4可知，當(dāng)色譜柱流量處于0.18～0.22 mL/min范圍時，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%，說明在此流量區(qū)間內(nèi)，色譜柱流量對測定結(jié)果的影響可忽略不計，方法靈敏度滿足檢測需求。綜合考量儀器運行過程中的固有波動，將色譜柱流量優(yōu)化設(shè)定為中間值0.2 mL/min，以確保分析方法的穩(wěn)定性。

表4   不同柱流量試驗結(jié)果

Tab. 4   Determination results of different flow rate

 

2.2 方法專屬性

分別取空白溶液、雜質(zhì)G-亞磺酸酯對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行分析，總離子流圖如圖4所示。

圖4   空白溶液、樣品溶液和對照品溶液總離子流圖

Fig. 4   Total ion chromatograms of blank solution， simple solution， reference solution

從圖4可以看出，樣品溶液和空白溶液均不會對雜質(zhì)G-亞磺酸酯檢測產(chǎn)生干擾，表明該方法專屬性良好。雜質(zhì)G-亞磺酸酯為手性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致該雜質(zhì)含有手性異構(gòu)體a和手性異構(gòu)體b如圖5所示。手性異構(gòu)體a和手性異構(gòu)體b在對照品溶液總離子流圖中呈現(xiàn)雙峰（見圖4），出峰時間分別為3.512 min和3.863 min，在后續(xù)驗證項目中，將上述兩個峰合并進(jìn)行研究。

圖5   手性異構(gòu)體a和手性異構(gòu)體b

Fig. 5   Chiral isomer a and chiral isomer b

2.3 線性方程和檢出限、定量限

取雜質(zhì)G-亞磺酸酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2儀器工作條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以雜質(zhì)G-亞磺酸酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。經(jīng)計算得出線性回歸方程為y=4 774.6x+30.593，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 0。表明雜質(zhì)G-亞磺酸酯質(zhì)量濃度在0.224~1.495 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。在1.2儀器工作條件下，對雜質(zhì)G-亞磺酸酯對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級稀釋后測定，分別以3倍和10倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度計算方法檢出限和定量限。根據(jù)稱樣質(zhì)量和定容體積，將上述濃度換算為樣品中的含量（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計），計算得出方法檢出限為0.5 mg/g，定量限為1.5 mg/g。

2.4 樣品加標(biāo)回收試驗

取一批樣品進(jìn)行低、中、高3個質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)回收試驗，每個質(zhì)量濃度水平平行制備3份加標(biāo)樣品溶液，按照1.2儀器工作條件進(jìn)行測定，計算加標(biāo)平均回收率，試驗結(jié)果見表5。

表5   樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果

Tab. 5   Results of spiked samples recycling test

 

由表5可知，樣品加標(biāo)平均回收率為98.5%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，滿足痕量物質(zhì)的檢測要求。

2.5 精密度試驗

參照2.4樣品加標(biāo)回收試驗中設(shè)定的中質(zhì)量濃度水平，平行制備6份加標(biāo)樣品溶液，按照1.2儀器工作條件進(jìn)行測定，并計算加標(biāo)平均回收率及測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗結(jié)果見表6。由表6可知，6份加標(biāo)樣品溶液的平均回收率為98.5%，測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%，表明該方法具有良好的精密度，可穩(wěn)定、可靠地用于相關(guān)檢測。

表6   精密度試驗結(jié)果

Tab. 6   Results of precision test

 

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗

按照1.3方法制備雜質(zhì)G-亞磺酸酯對照品標(biāo)溶液與加標(biāo)樣品溶液，于第0、2.5、5.5、7、10.5 h，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積，試驗結(jié)果見表7。由表7可知，雜質(zhì)G-亞磺酸酯對照品溶液與加標(biāo)樣品溶液在10.5h內(nèi)的色譜峰面積雖隨時間略有下降，但各時間點色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.6%和4.9%，表明峰面積波動處于試驗誤差范圍內(nèi)，雜質(zhì)G-亞磺酸酯在10.5h內(nèi)未發(fā)生明顯降解，溶液穩(wěn)定性良好。

表7   溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

Tab. 7   Results of solution stability test

 

3 結(jié)語

建立三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定舒巴坦鈉原料藥中雜質(zhì)G-亞磺酸酯含量的分析方法。該方法可實現(xiàn)痕量水平EP雜質(zhì)G-亞磺酸乙酯的準(zhǔn)確檢測，專屬性強，且已通過系統(tǒng)的方法學(xué)驗證，其應(yīng)用范圍可延伸至含舒巴坦鈉的各類復(fù)方制劑（如注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉、注射用哌拉西林鈉舒巴坦鈉、注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、注射用阿莫西林鈉舒巴坦鈉等），為該類藥物全產(chǎn)業(yè)鏈的質(zhì)量控制提供了統(tǒng)一、可靠的技術(shù)支撐，對保障臨床用藥安全性具有重要意義。

 

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