蘋果因含有豐富的礦物質(zhì)、維生素和有機(jī)質(zhì)等而深受人們的喜愛。然而，在生長過程中，蘋果容易受到來自土壤、農(nóng)用肥料和工業(yè)廢水中重金屬的污染。文獻(xiàn)在調(diào)研國內(nèi)水果中重金屬污染水平時(shí)發(fā)現(xiàn)鉛（Pb）、鎘（Cd）等多種重金屬元素存在超標(biāo)現(xiàn)象。鉻（Cr）、砷（As）、鎘、鉛、汞（Hg）等重金屬元素很容易通過食物鏈進(jìn)入人體，引發(fā)骨質(zhì)疏松、腎病、心血管病等多種疾病。因此，建立一種操作簡便、快速可靠的蘋果中多種重金屬元素的測定方法對維護(hù)人類健康顯得尤為重要。
在植物體中，重金屬元素常與生物大分子結(jié)合，以重金屬-有機(jī)酸或重金屬-谷胱甘肽復(fù)合物等形式存在，并伴有重金屬-纖維素的相互作用，直接提取并測定痕量重金屬元素較為困難。需要采取適當(dāng)?shù)那疤幚砑夹g(shù)破壞蘋果的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，解離重金屬元素與生物大分子之間的結(jié)合作用。相關(guān)方法常見的有濕法消解法和石墨消解法。但這些方法需要使用濃酸進(jìn)行高溫消解，這不僅會污染環(huán)境，還會造成揮發(fā)性元素?fù)p失。酶解法一直被認(rèn)為是一種可持續(xù)且環(huán)保的樣品前處理技術(shù)。在一個(gè)溫和的水解環(huán)境中，該方法通過酶將樣品中的生物大分子分解成更小的分子，從而將與這些生物大分子結(jié)合的重金屬元素釋放出來并進(jìn)入水相，但是單獨(dú)使用時(shí)也存在提取時(shí)間長（1～2h）的缺點(diǎn)。雙頻超聲波技術(shù)以超聲波清洗儀聯(lián)合超聲探頭產(chǎn)生更均勻和堅(jiān)固的氣泡，有助于加速生物細(xì)胞破壞、酶解和提取，但是國內(nèi)外還未見雙頻超聲波技術(shù)在輔助酶解提取蘋果樣品中多種重金屬元素中的應(yīng)用報(bào)道?；诖?，研究人員以雙頻超聲輔助
酶解法快速提取蘋果中 5 種重金屬元素，并采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定其含量。該方法綠色、簡單、快速，能夠用于蘋果樣品中 5種重金屬元素的同時(shí)提取和測定。
1試驗(yàn)方法
1.1 采集與制備樣品
新鮮蘋果樣品用水清洗，靜置干燥，使用破壁機(jī)將樣品攪碎，并于4℃低溫貯藏。
1.2 雙頻超聲輔助酶解樣品
稱取蘋果樣品和果膠酶置于離心管中，充分混合。加入緩沖液，在50℃水浴中超聲，離心，過尼龍濾膜，收集濾液。每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。
1.3 微波法消解樣品
取蘋果樣品，置于含有硝酸和30％過氧化氫溶液的聚四氟乙烯容器中，在如下升溫程序下進(jìn)行消解：10min內(nèi)將溫度升高至120℃，再在10min內(nèi)將溫度升高至 190℃，然后在190℃下保持30min。消解液冷卻至室溫，過尼龍濾膜，收集濾液。每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。
1.4 ICP-MS測定樣品
取濾液，用水稀釋10倍，按照儀器工作條件測定，測定結(jié)果取平均值。蘋果中含有豐富的果糖、纖維素、蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)，雙頻超聲輔助酶解后的樣品溶液若呈現(xiàn)渾濁不清的狀態(tài)，意味著殘留有部分可溶性有機(jī)質(zhì)，可能損害電感耦合等離子體質(zhì)譜儀。為保護(hù)儀器，再于120℃消解酶解濾液30min，然后用水稀釋10倍，按照儀器工作條件測定。
2結(jié)果與討論
2.1 酶的選擇
蘋果中基質(zhì)復(fù)雜，主要由水分、膳食纖維、果膠、蛋白質(zhì)、多糖等化學(xué)成分構(gòu)成。針對這幾種化學(xué)成分的特點(diǎn)，分別選取不同類型的5種酶 [中溫α-淀粉酶（pH 6.0）、α-淀粉酶（pH 6.0）、纖維素酶（pH 6.0）、風(fēng)味蛋白酶（pH 7.0）、果膠酶（pH 6.0）]在其最適酸度下處理蘋果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，所得的鉻、鎘、砷、鉛、汞的回收率見圖1。
由圖1可知，試驗(yàn)選擇采用果膠酶處理蘋果樣品。
2.2 果膠酶用量的選擇
在進(jìn)行雙頻超聲輔助酶解時(shí)，酶用量與酶解效率密切相關(guān)。按照試驗(yàn)方法分析蘋果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，考察了果膠酶用量（0.1～0.5 g）對5種重金屬元素回收率的影響，結(jié)果見圖2。
由圖2可知，試驗(yàn)選擇的果膠酶用量為0.4g。
2.3 緩沖液和料液比的選擇
緩沖液類型和料液比[樣品量（g）和緩沖液用量（mL）的比值 ]會影響酶解過程，因此試驗(yàn)考察了2-嗎啉乙磺酸、磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（分別記為MES、PBS、Tirs-HCl，酸度均為pH 6.0）緩沖液和料液比（1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3）對蘋果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中5種重金屬元素回收率的影響，結(jié)果見圖3。
由圖3可知，試驗(yàn)選擇了MES緩沖液，料液比1∶5。
2.4 超聲水浴溫度的選擇
考慮到果膠酶在適宜溫度區(qū)間內(nèi)才能發(fā)揮最優(yōu)效能，試驗(yàn)考察了超聲水浴溫度（20～60℃）對蘋果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中5 種重金屬元素回收率的影響，結(jié)果見圖4。
由圖4可知，試驗(yàn)選擇的超聲水浴溫度為50℃。
2.5 超聲探頭功率的選擇
在適當(dāng)?shù)某曒椛渌较拢笜?gòu)象會發(fā)生改變，可能提高對底物的轉(zhuǎn)化率。因此，試驗(yàn)考察了超聲探頭功率（450～810W）對蘋果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中5種重金屬元素回收率的影響，結(jié)果見圖5。
由圖5可知，試驗(yàn)選擇的超聲探頭功率為720W。
2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限
按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以各重金屬元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的響應(yīng)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，各重金屬元素的質(zhì)量濃度在0.1～500 μg·L−1內(nèi)和對應(yīng)的響應(yīng)強(qiáng)度呈線性關(guān)系，其他線性參數(shù)見表1。
按照儀器工作條件連續(xù)測定5次試劑空白溶液，以3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差s計(jì)算檢出限，結(jié)果均為0.01μg·kg−1。
2.7 精密度和回收試驗(yàn)
在5個(gè)新鮮蘋果樣品中各加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，使鉻、砷、鎘、鉛和汞加標(biāo)量均達(dá)到0.2mg·kg−1，放置48h 后采用試驗(yàn)方法測定，同時(shí)分析陽性樣品，每個(gè)樣品均重復(fù)測定6次，計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。
由表2可知，鉻、砷、鎘、鉛和汞的回收率為92.3％～104％，測定值的 RSD均小于5.0％，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均較好。
2.8 方法比對
按照試驗(yàn)方法分別采用微波消解法（簡稱微波法）和雙頻超聲輔助酶解法（簡稱超聲法）前處理蘋果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并按照儀器工作條件測定，每種方法均重復(fù)測定6次，結(jié)果見表3。利用 SPSS 軟件對兩種前處理方法的測定結(jié)果進(jìn)行成對樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。
結(jié)果顯示，本方法的5種重金屬元素的測定值均在認(rèn)定值的范圍內(nèi)，回收率為99.8％～105％，測定值的RSD均小于4.0％，進(jìn)一步證明該方法具有高準(zhǔn)確度和精密度；兩種方法的P值均大于 0.05，表明微波消解和雙頻超聲輔助酶解的測定結(jié)果沒有顯著性差異，雙頻超聲輔助酶解法可同時(shí)、有效提取蘋果中的5種重金屬元素。
3試驗(yàn)結(jié)論
研究人員提出一種雙頻超聲輔助酶解提取聯(lián)合ICP-MS測定蘋果中5種重金屬元素含量的方法。該方法可在水相中完成多種重金屬元素（鉻、砷、鎘、鉛和汞）的快速（15min）、同步提取，且過程無需使用強(qiáng)酸或進(jìn)行高溫處理；與傳統(tǒng)微波消解法相比，不僅簡化了提取步驟，還具備更好的環(huán)境可持續(xù)性、更高的提取精度以及良好的生物相容性，在食品和環(huán)境領(lǐng)域中多重金屬元素的環(huán)保高效提取和檢測方面擁有巨大應(yīng)用潛力。
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