所有的質(zhì)量研究工作都是建立在正確的化合物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之上的，本期我們先來說說化合物的結(jié)構(gòu)研究。
我們主要討論和研究的對象是原料藥（Active Pharmaceutical Ingredients，API，也可稱為Drug Substances，DS）。原料藥制備的要求是工藝可行、穩(wěn)定，能夠工業(yè)化生產(chǎn)，同時能制備出質(zhì)量合格的原料藥。它通常包括以下六個階段：
確定目標化合物:通過文獻調(diào)研或其它有關(guān)基礎(chǔ)研究工作，確定擬研發(fā)的目標化合物。
設(shè)計合成路線:根據(jù)目標化合物的結(jié)構(gòu)特性，參考國內(nèi)外相關(guān)文獻，綜合分析，確定工藝可行、成本合理、收率相對較高的合成路線。
制備目標化合物:通過化學(xué)反應(yīng)、生物發(fā)酵或其他方法制備出質(zhì)量符合要求的目標化合物，為產(chǎn)品進行結(jié)構(gòu)確證、質(zhì)量控制等藥學(xué)方面的研究提供合格的樣品。
結(jié)構(gòu)確證: 使用物理和化學(xué)方法，確證目標化合物的結(jié)構(gòu)。
工藝優(yōu)化:綜合考慮原材料獲得的難易程度、工藝路線的反應(yīng)條件、環(huán)保和安全、產(chǎn)品的純化等對生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化。
中試研究和工業(yè)化生產(chǎn):通過對中試和工業(yè)化生產(chǎn)工藝的研究，確定穩(wěn)定、可行的工藝，為藥物進一步研發(fā)提供符合要求的原料藥。
上期我們提到質(zhì)量研究的第一階段是注冊申報階段的質(zhì)量研究，因此我們看下注冊申報的CTD文件（Common Technical Document）中對化合物的結(jié)構(gòu)研究提了哪些要求：
我們可以看到在CTD資料中，關(guān)于結(jié)構(gòu)確證的要求放在了3.2.S.3 特性鑒定中。具體描述如下：
3.2.S.3.1 結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)
結(jié)合合成路線以及各種結(jié)構(gòu)確證手段對產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)進行解析，如可能含有立體結(jié)構(gòu)、結(jié)晶水/結(jié)晶溶劑或者多晶型問題要詳細說明。
提供結(jié)構(gòu)確證用樣品的精制方法、純度、批號，如用到對照品，應(yīng)說明對照品來源、純度及批號；提供具體的研究數(shù)據(jù)和圖譜并進行解析。
具體要求參見《化學(xué)藥物原料藥制備和結(jié)構(gòu)確證研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》。
（2）理化性質(zhì)
提供詳細的理化性質(zhì)信息，包括：性狀(如外觀、顏色、物理狀態(tài))；熔點或沸點；比旋度，溶解性，吸濕性，溶液pH,分配系數(shù)，解離常數(shù)，將用于制劑生產(chǎn)的物理形態(tài)（如多晶型、溶劑化物或水合物），粒度等。
接著我們再通過指導(dǎo)原則來看看結(jié)構(gòu)確證的具體內(nèi)容和要求。
首先指導(dǎo)原則中指出了結(jié)構(gòu)確證研究的“常規(guī)套路”，即根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特征制訂科學(xué)、合理、可行的研究方案，制備符合結(jié)構(gòu)確證研究要求的樣品，進行有關(guān)的研究，對研究結(jié)果進行綜合分析，確證測試品的結(jié)構(gòu)。
然后，對于結(jié)構(gòu)確證的研究方案和內(nèi)容，指導(dǎo)原則中根據(jù)不同化合物的結(jié)構(gòu)特點進行了分類，主要包括以下八大類。
一般藥物
手性藥物
不含金屬的有機鹽類化合物
金屬鹽類和絡(luò)合物
半合成藥物
多晶型藥物
含有結(jié)晶水和結(jié)晶溶劑的藥物
多組分藥物
1、一般藥物
采用常規(guī)方法，如元素分析(必要時采用高分辨質(zhì)譜)、UV、IR、NMR、MS、熱分析(差熱或熱重)、粉末X-衍射(XRPD)等即可確證藥物的結(jié)構(gòu)。
圖1 對乙酰氨基酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
若存在順反異構(gòu)，在一般結(jié)構(gòu)確證的基礎(chǔ)上，應(yīng)增加順反結(jié)構(gòu)的研究。
圖2 氯普噻噸的順反結(jié)構(gòu)
2 、手性藥物
手性藥物又可細分為以下幾種情況：
1）單一對映體：其絕對構(gòu)型確證常用的方法為：比旋度測定、手性柱色譜、核磁共振（NMR）、單晶X-衍射（XRSD）以及旋光色散（Optical rotatory dispersion，ORD）、圓二色譜（Circular dichroism，CD）等。其中單晶衍射為直接方法，可提供最直接的信息。
2）藥物分子中含有多個不對稱因素：應(yīng)對其絕對構(gòu)型、對映體純度（非對映體純度）進行相關(guān)的研究，并盡可能提供更多的構(gòu)型確證信息。
3）立體異構(gòu)混合物：需進行各立體異構(gòu)體比例的確證研究。對于已有實驗證據(jù)或文獻報道立體異構(gòu)體在藥效、藥代動力學(xué)或毒理等方面有明顯不同或有相互作用的藥物，更有必要測定混合物中各組分的構(gòu)型和比例。
圖3 右丙氧芬（右圖）和左丙氧芬（左圖）
4）外消旋體或富集對映體：可通過測定旋光度或采用手性色譜及核磁共振譜等方法闡明其對映體的比例。
圖4 鹽酸奈比洛爾的結(jié)構(gòu)式
3 、不含金屬元素的有機鹽類或復(fù)合物
根據(jù)結(jié)構(gòu)確證的需要，可提供成鹽前后的兩套波譜和試驗數(shù)據(jù)。對于某些波譜測定有困難或不易說明藥物結(jié)構(gòu)的鹽或復(fù)合物，測定藥物的酸根或堿基的波譜，并結(jié)合其它試驗項目亦可對其結(jié)構(gòu)確證提供有效的信息。
圖5 枸櫞酸噴托維林的結(jié)構(gòu)式
4 、金屬鹽類和絡(luò)合物
在進行一般要求的各項測試基礎(chǔ)上，考慮以適當手段反映藥物中金屬元素的種類、存在形式和含量的確證試驗。不適于或不能測試金屬鹽本身的項目，可考慮以成鹽前的酸分子或配位體的相應(yīng)測試結(jié)果進行佐證。
圖6 匹伐他汀鈣的結(jié)構(gòu)式
5 、半合成藥物
分子中母核的結(jié)構(gòu)為已知并在可提供明確證據(jù)證明原分子母核結(jié)構(gòu)在半合成全過程中未發(fā)生改變的前提下，可適當簡化對母核部分結(jié)構(gòu)的確證工作，僅對新引入的基團結(jié)構(gòu)進行確證。
圖7 阿莫西林的結(jié)構(gòu)式
6 、多晶型藥物
在進行一般要求的各項測試基礎(chǔ)上，應(yīng)以適當方法獲得藥物晶型數(shù)據(jù)。藥物晶型測定常用方法為粉末衍射（XRPD）、紅外吸收光譜、熔點、熱分析、光學(xué)顯微鏡等。分為兩種情況：
新化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物應(yīng)進行藥物在不同結(jié)晶條件下（溶劑、溫度、結(jié)晶速度等）是否存在多種晶型的研究。
已有文獻報道存在多晶型的藥物應(yīng)明確藥物晶型的類型和純度。對于混晶藥物，應(yīng)測試其晶型組成（種類、比例），并與文獻數(shù)據(jù)比較。對于因晶型影響藥物的溶解性、穩(wěn)定性、生物利用度和活性的藥物，在無相應(yīng)藥理毒理等研究證明該晶型的安全和有效性時，應(yīng)確證自制品與國外上市藥品晶型的一致性。
7 、含有結(jié)晶水或結(jié)晶溶劑的藥物
對于含有結(jié)晶水或結(jié)晶溶劑的藥物，應(yīng)對藥物中的水分/溶劑進行分析。常用分析方法為熱重、差熱分析、干燥失重、水分測定、核磁共振以及單晶衍射。
熱重分析（TGA）：藥物在程序升溫條件下物質(zhì)質(zhì)量（或重量）隨溫度變化，可獲得藥物的吸附水/溶劑、結(jié)晶水/溶劑及初步的分解溫度等信息。結(jié)合差熱分析的結(jié)果，還可判斷測試藥物在熔融時分解情況。
差熱分析（DSC）：藥物在程序升溫條件下獲得藥物的物理狀態(tài)與溫度的關(guān)系，可推測出測試藥物的吸附水/溶劑、結(jié)晶水/溶劑以及熔點、有無多晶型存在和熱焓值等信息。
干燥失重：藥物在規(guī)定的條件下干燥至一定程度，并計算減少的重量，可以獲得藥物中的結(jié)晶水或溶劑、吸附水或溶劑的含量。
水分測定：可以獲得樣品中總含水量的信息（結(jié)晶水或吸附水），但不適用于溶劑的測定。
單晶衍射：在提供藥物元素組成、分子量及結(jié)構(gòu)的同時，還可提供藥物中以結(jié)晶形式存在的水或溶劑的信息，包括結(jié)晶水或溶劑的種類、數(shù)量、存在方式等。
8、多組份藥物
對于多組分藥物，應(yīng)明確各組份的組成比例，對其主要成分應(yīng)進行結(jié)構(gòu)確證。
圖8 LCZ696的結(jié)構(gòu)式
另外，指導(dǎo)原則中提出了結(jié)構(gòu)確證的樣品要求：
在結(jié)構(gòu)確證的研究中，測試樣品的純度需要進行一定的控制，只有使用符合要求的測試品進行結(jié)構(gòu)研究，才能獲得藥物正確的結(jié)構(gòu)信息。
一般情況下，應(yīng)采用原料藥制備工藝中產(chǎn)品的精制方法對樣品進行精制，并采用質(zhì)量標準中的方法測其純度和雜質(zhì)，供試樣品的純度應(yīng)大于99.0%，雜質(zhì)含量應(yīng)小于0.5%。
我們再補充幾點說明：
1、元素分析可獲得組成藥物的元素種類及含量。測試結(jié)果與理論結(jié)果差值的大小應(yīng)小于0.3%。在保證高純度情況下可采用高分辨質(zhì)譜方法。
2、紫外吸收光譜可初步確認結(jié)構(gòu)中發(fā)色團、助色團及它們的連接方式。若發(fā)色團上存在酸性或堿性基團的藥物，可通過在酸性或堿性溶液中（用0.1mol/L HCl或NaOH），進行最大吸收波長的測試，觀察其藍移或紅移現(xiàn)象，可為上述酸性或堿性基團的存在提供進一步的支持。
3、紅外吸收光譜可初步確認結(jié)構(gòu)中化學(xué)鍵、官能團及其連接方式。固態(tài)藥物紅外測試可采用壓片法、糊法、薄膜法，液態(tài)藥物可采用液膜法測試，氣態(tài)藥物則可采用氣體池測定。
部分含多晶型藥物在研磨和壓片過程中，其晶型可能發(fā)生變化，可改用糊法測定，同時應(yīng)根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)特點對糊劑的種類進行選擇。
鹽酸鹽藥物在采用KBr 壓片時可能會發(fā)生離子交換現(xiàn)象，應(yīng)分別對氯化鉀壓片和溴化鉀壓片法測得的結(jié)果進行比較，并根據(jù)結(jié)果選擇適宜的壓片基質(zhì)。
4、核磁共振可確認特定元素在分子中的類型、數(shù)目、相互連接方式、周圍化學(xué)環(huán)境以及空間排列等信息，進而推測出化合物結(jié)構(gòu)中相應(yīng)官能團的連接情況和初步的結(jié)構(gòu)。常用的有氫譜(1H-NMR)和碳譜(13C-NMR)等。核磁共振測試的重要參數(shù)有化學(xué)位移(δ )、偶合常數(shù)(J值)、峰形、積分面積等。
氫譜測試的NOE或NOESY 試驗，可給出某些官能團在分子中位置、優(yōu)勢構(gòu)象及構(gòu)型。
對含有活潑氫的藥物必需進行氘代實驗，以提供活潑氫的存在以及位置的信息。
DEPT譜可進一步明確區(qū)分碳原子的類型，對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的藥物，DEPT譜對結(jié)構(gòu)解析可給予更加有力的支持。
5、質(zhì)譜主要用于原子量和分子量的測定，以及同位素的分析。分子離子峰是確證藥物分子式的有力證據(jù)，應(yīng)根據(jù)藥物自身結(jié)構(gòu)特性選擇適宜的離子源和強度，同時盡可能地獲得分子離子峰和較多的、可反映出藥物結(jié)構(gòu)特征的碎片峰。
對含有同位素元素（如Cl、Br等）的藥物，利用分子離子峰及其相關(guān)峰豐度間的關(guān)系，可以判斷藥物中部分組成元素的種類、數(shù)量。
高分辨質(zhì)譜是通過精確測定分子量確定藥物分子式，但它不能反映藥物的純度和結(jié)晶水、結(jié)晶溶劑、殘留溶劑等情況。
6、在結(jié)構(gòu)確證研究中，參考文獻和結(jié)構(gòu)確證用對照品對結(jié)構(gòu)確證具有重要的佐證意義，但不是藥物結(jié)構(gòu)確證研究的必要條件。所用的參考文獻應(yīng)引自國內(nèi)外權(quán)威雜志或?qū)＠珣?yīng)注意的是不同的測試條件所得到的測試 結(jié)果亦可能有所差異。
7、結(jié)構(gòu)確證所用對照品的結(jié)構(gòu)信息對藥物的結(jié)構(gòu)確證亦具有重要的佐證作用，不同來源的結(jié)構(gòu)確證用對照品對藥物結(jié)構(gòu)確證的佐證程度不同。結(jié)構(gòu)確證用對照品和測試樣品應(yīng)在同一儀器上采用相同的測試條件進行測試，其純度應(yīng)不低于精制品純度，以保證結(jié)構(gòu)確證用對照品對藥物結(jié)構(gòu)確證的支持。
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